这个在线站点功能非常丰富，可以选择基因编辑工具的其他用途（激活，抑制基因表达等）（图1-1）。下一步就是选择物种（图1-2）。但只有常见的9种。再下一步就是直接输入基因的名称（或序列）即可（图1-3）。

图1-1 选择编辑类型

图1-2 选择物种

图1-3 选择基因名称。

但是出来的sgRNA位置有一些并不总在ATG的下游（图2所示，1，2，6，9，12，16，22几条sgRNA位于ATG的上游）。所以根据位置，对于做基因的敲除（KO）而言， 强烈建议选择 ATG 下游通常 100 aa 以内范围内的 sgRNA 来用（比如图 3 中的 3 ， 5 ， 7 ， 10 等较下游的）；而且，一定要位于 CCDS 区域内（ CCDS 是 consensus CDS ，即公共的 CDS 区域，是针对很多个转录本 [isoforms] 定义，图 2 中路色条框即是。这个很重要！！！）。

图2

●   Feng Zhang lab： http://crispr.mit.edu/

这是最早的一个设计站点。包括常见的16个物种。选中物种，把你要设计的区段序列扔到下面的框里运行就行。。但前提是你自己已经选好了位置（图3）

图3

这个站点内容更加丰富，比如物种覆盖式最多的，包括植物，昆虫等等（图4左）。这个站点也是输入目的基因的序列定制的，不同的是可以有较大的自由度选择位置预测。

图4

• 还有一些商业公司的，比如Thermo下面的（图5）：

https://apps.thermofisher.com/crispr/index.html#/search

物种较少，商业性目的特别强，了解下即可。

图5

图6

手动版本虽然费事，但有时候却会事半功倍，节约后续鉴定单克隆的成本。我们举例来说：

图7

序列中PAM和sgRNA的序列放大如下（前提是sgRNA位于CCDS区域，而且特异性要保证）：

图8

也即我常说的，让Cas9切割位置（确定的）跨过一个酶切位点（比如sfcI）（在前两篇文章中都有所提及）。这样， 在 Cas9成功编辑靶序列产生indels的时候，酶切位点一定会遭到破坏 。 这为后续的单克隆鉴定提供了便利。请看示意图（图9）：

图9

注意一点： PCR引物设计的时候确保PCR片段内部不要出现第二个SfcI的酶切位点。这样后面酶切的时候结果是唯一的。实验流程和鉴定结果应该是这样的（图10）：

↓

图10

对于WT，酶切是充分的，不会残留。而对于成功编辑的两个mixture：*1和*2，由于产生了indels，部分sfcI的位点造到破坏，sfcI切不动的。对于成功编辑的单克隆而言，应该是一点都切不动。后续鉴定只要这样的克隆去测序即可（图11，红色编号为阳性克隆）。

图11

TA克隆结果（图12）：

图12

因为以上介绍的站点没用涉及Cpf1和saCas9，特别是saCas9（非常适合AAV介导的载体基因编辑）： http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html 这个网站兼容几乎所有类型的Cas9设计。

打开页面，输入要编辑区域的基因组序列，然后在PAM类型里选择你需要的Cas9类型，比如spCas9，saCas9以及cpf1等。其他条件默认设置即可，然后点击sunmit即可。非常傻瓜式的操作（图13，14）

图13

图14