实验笔记丨CRISPR-dCas9实验步骤详解

VeryGenome多组学

唯誉智合科技有限公司，提供基于质谱技术的定制检测分析服务

CRISPR/Cas9 基因编辑技术的基本原理是，Cas9 蛋白与人工设计的 sgRNA 结合成为 sgRNA-Cas9 蛋白复合体并在其引导之下结合到特定的核苷酸序列切割目标 DNA分子造成双链断裂，细胞内非同源末端连接的方式（NHEJ）造成断裂位点随机插入、删除等突变。CRISPR/Cas9 系统通过这种方式引入特定位点的突变。实验笔记丨CRISPR-dCas9实验步骤详解
CRISPR/Cas9 基因编辑技术的基本原理是，Cas9 蛋白与人工设计的 sgRNA 结合成为 sgRNA-Cas9 蛋白复合体并在其引导之下结合到特定的核苷酸序列切割目标 DNA分子造成双链断裂，细胞内非同源末端连接的方式（NHEJ）造成断裂位点随机插入、删除等突变。CRISPR/Cas9 系统通过这种方式引入特定位点的突变。

dCas9 是通过抑制Cas9 核酸酶的 RuvC 和 HNH 两个结构域的活性来得到的，在此之后得到的 dCas9 系统只有结合基因组序列的能力却没有在基因组序列上切割的能力。CRISPR /dCas9 系统分别融合一个激活元件或一个抑制元件时会产生基因激活或者抑制的功能。随着dCas9 发现和应用的成熟，CRISPR-dCas9 系统应运而生，逐渐成为科学家分子生物学用于激活和抑制基因表达研究的新工具。

sgRNA 的设计

sgRNA，单链引导 RNA，作为 CRISPR/Cas9 系统中 cas 蛋白的引导序列，可参照 sgRNA 工具网站 ( http:// crispr.mit.edu ) 设计多条 sgRNA 以降低脱靶率。

sgRNA 质粒的构建方法

1）用 BbsI 在 37℃条件下酶切载体质粒 pAC1371。

2）琼脂糖凝胶电泳，切胶用 DNA 片段回收试剂盒回收目的载体片段

3）引物退火

使用以下参数在 PCR 环仪中进行退火:

37℃ 30 分钟，95℃ 5 分钟，然后以每分钟降低 5℃的速度将温度降到 25℃

4）连接酶连接。

5）质粒转化（Transformation）

A）取一支储存在-80℃的 DH5a 感受态细胞放在冰盒里解冻（切不可用手直接握住感受台细胞底部），解冻后将 5-10µL 连接产物加入到感受态细胞中，用枪头轻柔吹混匀（切不可剧烈震荡吹打），在冰盒里静置孵育 25-30 分钟。

B）冰上孵育后将感受态细胞放在提前调节温度至 42℃水浴锅中热激 90 秒。重新转移冰盒里静置孵育 5-10 分钟。

C) 加入 500μL 提前预热至室温的液体培养基，置于 37℃摇床中复苏摇菌 1 小时。

D） 3000 转离心 3 分钟，弃掉部分上清液，用灭菌冷却至室温的玻璃棒涂板，置于 37℃培养箱中过夜生长。

6）随机挑取独立生长的菌斑于液体培养基中培养 6-8 小时，进行菌落 PCR。

7）将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像仪成像，选取阳性菌落送去测序公司进行测序鉴定。

8）根据测序结果选取目的菌落扩大培养，提取质粒，备后续实验室用。

脂质体转染细胞

1）准备：细胞准备，将长势良好 HEK293T 细胞按一定数量传代，如：六孔板 1.5*10⁶/孔，传代时培养基需预热。

2）将长势良好，密度适当的 HEK293T 细胞更换一半新鲜培养基（培养基需要预热，更换培养基时，轻柔操作，不要将贴壁生长的 HEK293T 细胞吹起来）。

3） pMD2.G: 1µg+paspax2: 1µg +transgene: 2µg+optimem: 0.125mL 混匀，室温静置5 分钟， lipofectamine 2000：8µL+optimem: 0.125mL 混匀，室温静置 5 分钟。

4） 5 分钟后将步骤 2 中的两种混合物混合在一起，轻柔混匀，室温静置 15 分钟。

5）将 3）中混合物加入 6 孔板中，每孔加 250µL（加样时使混合物均匀分布在孔中）。

6）放入培养箱继续培养。6 小时后，去除并更换 HEK293T 细胞包装培养基 2mL 。

7）按时用显微镜观察细胞生长状况或者荧光表达情况，并拍照取材。

8） RNA 提取，反转录成 c DNA。Real-time PCR 鉴定基因表达水平。

The surveyor assay of insertion and deletion分析 CRISPR/Cas9 系统在特定位点的作用效率

CRISPR/Cas9 系统在真核细胞中切割会造成 DNA 双链的断裂，我们采用 Dmitry Y.Guschin 等人用来分析 zinc finger nucleases (ZFN)造成的基因突变得方法来分析CRISPR/Cas9 系统作用效率。这种方法依赖于 Surveyor nuclease 的功能。将发生突变位点通过 PCR 将产物量放大，重新形成单链后退火使正常的序列与发生突变的序列形成错配，这种错配可以被 Surveyor nuclease 所识别并切开。通过这种方式可以很清楚的分析 CRISPR/Cas9 系统在特定位点的作用效率。

1）收集 HEK293T 细胞，1000 转离心 3 分钟，弃尽上清液，加入 PBS 将细胞重悬收集在 1.5mLEP 管内，用 PBS 洗一次。

2）取适量细胞 1000 转,3 分钟离心，弃尽上清液。

3）加入 PCR 裂解液（1000 个细胞/1μL PCR Lysis buffer）。

4） 50℃，1 小时;95℃,15 分钟;4℃, 10 分钟。

5） PCR 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 是否有目的条带。

6) 退火：

3μL PCR 产物

6μL 1xBufferⅡ

95℃,5 分钟,95–85℃at –2◦C/s, 85–25ºCat –0.1℃/s; 4℃, 10 分钟。

7) 将产物放在冰上，加入 0.5μL Surveyor nucLease S 。

PCR 42℃，20 分钟;4℃, 10 分钟。

8) 加入 2μL 10×orange Loading buffer