活细菌不仅包括能够在传统培养基上生长并形成菌落的细菌，还包括大量具有活性但不可培养的细菌(viable but nonculturable，VBNC) ^{[ 27 ]} 。VBNC状态的细菌虽然失去了在传统培养基上生长繁殖的能力，但依然具有细胞膜完整性和代谢活性 ^{[ 27 ]} ，对于发酵的正常进行具有重要作用。细胞膜的完整与否是PMA鉴别活/死细胞的理论基础，完整的细胞膜能够帮助VBNC状态细菌抵抗PMA的侵入，有效提升了活菌检出率。但同时一些研究 ^{[ 13 ]} 表明PMA对细胞膜的渗透性相对“温和”，尤其是对于一些细胞膜轻微损伤的细菌，PMA难以透过细胞膜与DNA结合。通过优化PMA处理条件或适量添加促进物质(如脱氧胆酸钠、二甲亚砜和乙二胺四乙酸等)能够增强PMA对死亡细胞/膜损伤细胞细胞膜的渗透性 ^{[ 13 ]} ，提高检测准确性。本研究针对5种乳杆菌，优化了包括PMA浓度、暗孵育时间及曝光时间在内的3个主要参数，最终抑制了99.89%的死菌DNA扩增，保证了活菌检测准确性。尽管如此，还有诸如细菌丰度及组成、活细胞与死细胞之间的比例及样品盐含量等因素 ^{[ 13 , 28 ]} 可能影响PMA处理的有效性。不同微生物对于PMA的敏感度有所差异，Lai等 ^{[ 28 ]} 研究发现曝光时间从5 min增加到15 min能够显著增加PMA对 Lactobacillus gasseri 死菌的抑制效果，而不改变对 Lactobacillus salivarius 的处理效果，这可能是两种乳杆菌细胞膜组成的差异造成的。Lv等研究发现随着PMA浓度、暗孵育时间和曝光时间的增加，PMA对 Lactobacillus plantarum 死菌的抑制率逐渐增加，达到最佳条件后，浓度/时间的增加不再显著改善PMA对死菌的抑制效果 ^{[ 10 ]} ，与本文研究结果相似。根据不同微生物采取不同的PMA处理方式能够获得更准确的检测结果 ^{[ 16 ]} 。

为了能够在种水平上区分不同的乳杆菌，我们检索文献及数据库，最终筛选出了5对高特异性的引物。其中4对(LFermF/LFermR、s-Lbre-F/s-Lbre-R、Acidfor/Acidrev、LcaseF/LcaseR)是基于16S rRNA基因设计的。16S rRNA基因是最常用于细菌鉴定与检测的核酸序列，也是qPCR法检测细菌含量最常用的区域。合理利用16S rRNA基因的不同分区 ^{[ 29 ]} ，能够较准确地区分不同细菌。此外，基于管家基因 recA 设计的植物乳杆菌qPCR引物(LPrecAF/LPrecAR)也表现出了良好的特异性，表明用于qPCR法测生物量的引物不应局限于16S rRNA基因。大量基于16S-23S rRNA基因间区 ^{[ 30 ]} 、23S rRNA基因 ^{[ 31 ]} 以及各种管家基因 ^{[ 19 ]} 的引物被设计出来并用于细菌的检测，这也使得在菌种水平，甚至是菌株水平上检测某种微生物的含量成为了可能。根据不同微生物找到其最区别于其他微生物的靶基因区域，设计出高度特异的引物是未来的发展趋势。

基因组拷贝数与菌落浓度之间一一对应的关系使得可以通过基因组拷贝数反映菌落浓度。我们通过梯度稀释目标微生物基因组DNA，构建了扩增信号 C _q 值与菌落浓度(log ₁₀ CFU/mL)之间的标准曲线，展现出了良好的线性关系( R ² > 0.98)。同时PMA-qPCR与平板计数法的检测结果在统计学上没有显著性( P > 0.05)，且 C _q 值的变异系数小于1%，证明了该方法的稳定可靠性。5种乳杆菌的定量检测限如 表 3 所示，其变化范围从10 ^1.8 CFU/mL到10 ^3.2 CFU/mL，较高的检测限可能与样品制备过程中DNA的丢失有关。事实上，qPCR本身的检测限非常低(每个反应中含有1-10个目标基因即可)，在100%扩增效率的前提下，其对微生物的检测限是12-120 CFU/mL ^{[ 14 ]} 。为了提高检测的灵敏度，可以考虑将PMA处理与DNA提取融合到一个程序中，减少前处理的步骤，降低DNA的损失 ^{[ 15 ]} 。

我们建立的PMA-qPCR法在黄酒中乳杆菌活菌数检测中的成功应用，展现了其在检测活菌绝对含量中的巨大潜力。一方面，PMA-qPCR法克服了基因组测序和PCR-DGGE无法检测微生物绝对含量的缺点；另一方面，与传统的平板计数法相比，PMA-qPCR省去了1-2 d的细菌培养时间，使得整个检测过程能够在3 h内完成，而且能够检测到传统的平板计数法无法检测到的VBNC状态细菌，获得更为准确的活菌检测结果。PMA-qPCR方法的建立不仅能准确描述乳杆菌活菌数的实时原位动态，还可为研究其他发酵体系中不可培养的乳杆菌相关代谢功能提供参考。