张定宇团队最新研究，单细胞“剪刀（SCISSOR）算法”又立功

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脓毒症（Sepsis） 是一种由感染引起的严重的全身性炎症反应综合征，由宿主对感染的反应失调引起，死亡率极高。肺是败血症中第一个也是最常见的受损器官，大约50%的败血症患者会发展为 急性肺损伤(ALI) 。脓毒症诱导的肺损伤包括一个复杂的肺结构组成细胞和免疫细胞相互作用的微环境。大量的 免疫细胞和非免疫细胞 参与了脓毒性肺损伤的发生和发展。然而，目前关于脓毒性肺损伤病理机制的细胞水平研究相对独立，大多数研究仅集中在上皮细胞、内皮细胞、单核细胞、中性粒细胞等肺细胞成分中的一、两种，缺乏对肺损伤过程中整体细胞变化的系统解释。因此，迫切需要阐明感染性肺损伤时肺组织免疫细胞和非免疫细胞的整体格局和异质性。

单细胞 “剪刀”（SCISSOR）算法 是指通过利用批量数据及其注释的各类表型信息，自动从单细胞数据中选择对表型差异最重要的细胞亚群的算法。

近日，来自华中科技大学同济医学院 张定宇 教授团队发表了题为“ Integrating bulk and single-cell sequencing reveals the phenotype-associated cell subpopulations in sepsis-induced acute lung injury ”的文章。研究人员利用已建立的脓毒症肺损伤小鼠模型，通过生成 25044 个细胞的 scRNA-seq 谱，报道了感染小鼠肺中广泛的细胞组成谱，并且还用 “剪刀法” 鉴定了与 脓毒性肺损伤表型密切相关的细胞亚群 ，并揭示了这些亚群的特异性基因、基因功能富集以及与其他细胞簇的相互作用。

主要结果

1、脓毒症诱导的肺损伤细胞scRNA-seq图谱

研究人员分别建立了利用盲肠结扎术（CLP）诱导脓毒症的CLP、CLP-48h、假手术（Sham）小鼠小组并取肺组织样本进行后续检测和分析。

经过数据质控后，他们对总共25044个肺细胞进行了下游分析，其中Sham组细胞6825个，CLP组细胞9914个，CLP-48h组细胞8305个。根据典型标记基因的表达（图1E），将细胞聚类分为14种主要细胞类型（图1C），并根据CD45的表达将细胞分为免疫细胞和非免疫细胞，之后比较了每种细胞类型的相对百分比。在免疫细胞中(图1G)，中性粒细胞、单核细胞和T细胞是最常见的三个亚群，而在非免疫细胞部分(图1H)，内皮细胞和成纤维细胞相对占优势。

图1

2、单核细胞异质性分析

单核细胞是抵抗感染的第一道防线。基于标记基因的表达(图2B)，研究者将单核细胞分为6个亚群(图2A)，包括肺泡巨噬细胞、Mono0、MacroCxcl3、MacroMrc1、MacroGrk3和Mono1。细胞比例分析显示，Mono1在CLP组中的比例高于CLP-48h组，提示Mono1可能与脓毒症肺损伤的急性期密切相关（图2C）。此外，“剪刀法”提示Mono1聚类是与脓毒症诱导的肺损伤表型最相关的亚聚类(图2D)。伪时间分析表明(图2E)，Mono0与Mono1聚类是有区别的，Mono1群体可能是脓毒性肺损伤情况下从外周血迁移而来的特定细胞群。研究者进一步鉴定了Mono1的DEGs，如预期的那样，Mono1的DEGs具有促进炎症反应的特征，包括S100A8/A9、Hmgb1、Mmp8等。细胞互作网络分析显示，Mono1表达较高水平的CCR1（受体包括CCC15、CCL18、CCL23）；有趣的是，Mono1细胞的CCC15、CCL18和CCL23也高表达。此外，上述CCR1受体配体对主要在单核/巨噬细胞和中性粒细胞的一些亚群中表达。这表明，Mono1的趋化性是由其他免疫细胞调节的，并且Mono1也负责某些其他免疫细胞的浸润。

图2

3、中性粒细胞异质性分析

肺组织中性粒细胞的过度积聚和激活是脓毒性肺损伤的主要病理特征。基于标记基因的表达，中性粒细胞群体分为4群，包括Neu0-Ccl6，Neu1-Krt83，Neu2-Csta2，Neu3-Cxcl3。细胞比例分析表明，CLP组Neu3-Cxcl3亚簇比例明显增高。此外，对中性粒细胞成熟的标志-Mme进行分析发现，虽然其整体表达水平很低，但在Neu3-Cxcl3亚群体中Mme的表达水平仍明显低于其他亚群(附图3A)。伪时间分析也表明，Neu3-Cxcl3亚群更有可能来自外周血，然后分化为Neu0-Ccl6，然后分化为Neu1-Krt83和Neu2-Csta2。剪刀法提示CLP和CLP-48h组中几乎所有中性粒细胞都与脓毒性肺损伤表型相关。综合上述结果，可认为Neu3-Cxcl3亚群是CLP组肺损伤的主要驱动因素。细胞互作网络进一步分析，Neu3-Cxcl3高表达趋化因子受体CCR1，其配体在多种免疫细胞中均有表达，提示感染性肺损伤时中性粒细胞的迁移和浸润受多种免疫细胞调控。

图3

附图3A

4、淋巴细胞异质性分析

根据经典T细胞标志物的表达，研究者鉴定出5个T细胞亚群(图4B)，包括“CD8 Tcell”、“Th17 cell”、“CD8 TCM”、“CD4 Tcell”和“ILC2”(图4A)。细胞比例分析显示，与Sham组相比，CLP组CD8 Tcell比例明显降低，ILC2细胞比例明显升高(图4C)。剪刀法表明ILC2是与脓毒症表型最相关的亚群(图4D)。作为EGF家族的一员，双调节蛋白(amphiregulin, Areg)在急性上皮损伤和哮喘的组织修复调节中发挥重要作用，ILC2是肺中Areg的重要来源，然而，在感染性肺损伤中，ILC2中Areg的表达明显被抑制(图4G)，这可能是脓毒性肺损伤的重要机制之一。

图4

5、内皮细胞异质性分析

研究者将内皮细胞(ECs)分为6组亚群，包括毛细血管ECs-Sema3c，毛细血管ECs-Ednrb，淋巴ECs，动脉ECs，静脉ECs，毛细血管ECs(图5A)。各组内皮细胞组成百分比显示，百分比变化最明显的细胞亚群为毛细血管ECs- ednrb和毛细血管内皮细胞(图5C)。剪刀法显示，毛细血管Ecs-Sema3c和毛细血管Ecs是内皮细胞对抗脓毒症肺损伤的主要细胞，而淋巴Ecs与脓毒症的进展密切相关(图5D)。DEGs表明，淋巴ECs与粒细胞迁移相关，因此研究者接下来探索了CLP组淋巴ECs和其他免疫细胞的细胞互作网络（附图5A），结果显示CLP组的淋巴ECs主要表达Ccl7（附图5B），其受体包括Ccr1和Ccr2，从而对中性粒细胞和单核细胞的某些亚群发挥趋化作用。值得注意的是，CLP组淋巴细胞ECs和与脓毒性肺损伤表型密切相关的亚群(如Mono1和neutrophilcxcl3)之间存在显著的相互作用。

图5

附图5

6、成纤维细胞异质性分析

研究者基于标记基因，将成纤维细胞分为7个亚群（图6A-B），正常小鼠和脓毒症小鼠肺组织的纤维囊性成分有显著差异(图6C)。剪刀法显示CLP组的大部分成纤维细胞并非没有脓毒性肺损伤，特别是Fib0-Saa1和Fib2-Ces1d亚群的组成细胞(图6D)。此外，GO富集分析表明，CLP组成纤维细胞的差异基因主要集中在急性炎症反应、脂蛋白相关通路和活性氧通路。细胞互作分析显示CLP组成纤维细胞主要表达Ccl7(附图6C)。值得注意的是，CLP组的成纤维细胞，类似于淋巴ECs，都表现出与脓毒性肺损伤表型相关的细胞亚簇的显著趋化性，包括Mono1和neu-Cxcl3。

图6

附图6

结论

研究团队首次系统地提供了脓毒症肺损伤中肺组织的细胞转录图谱，并且还鉴定了与脓毒性肺损伤表型最相关的细胞亚群，并揭示了这些亚群的转录特征。这些研究成果将有助于更好地理解不同肺细胞群在脓毒症诱导的肺损伤中的致病作用，并为未来发现有效的治疗策略提供必要的资源。

END

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