目前设计sgRNA的网站比较多，张锋老师实验组总结了sgRNA设计工具如：
https://zlab.bio/guide-design-resources
，其中synthego（
https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool
）是小编比较喜欢用的设计工具。不过该网站只能设计人、果蝇和小鼠基因的sgRNA。以人的基因TP53为例，介绍TP53基因sgRNA的设计过程。
1.1 打开synthego网站sgRNA设计工具，点击
Launch Design Tool
1.2 选择种属人Homo sapiens，人的TP53基因的ID号为7157，选择TP53基因，点击search；
1.3 搜索结果分两部分：推荐的sgRNA和所有的sgRNA。往下滚动滚轮，会看到四条推荐的sgRNA的序列。
1.4 点击其中一条sgRNA序列，会看到sgRNA在TP53基因上的具体作用位置；
以lentiCRISPRv2载体为例，说明sgRNA是如果构建到该载体中。首先，将设计好的sgRNA中的U碱基改成T碱基，如TP53基因的sgRNA序列为5’-CAUUGCUUGGGACGGCAAGG-3’，修改后的碱基为5’-CATTGCTTGGGACGGCAAGG-3’，该序列的反向互补序列为3’-GTAACGAACCCTGCCGTTCC-5’。正向序列和反向互补序列退火成双链后就可以连接到载体中，但是需要在序列两端添加BsmBI酶切后的同源序列，如下图所示：
在生工生物合成这两条互补的序列后，退火成双链就可以连接到用BsmBI酶切后的LentiCRISPRv2载体中。sgRNA载体构建具体的操作过程如下。
2.1 LentiCRISPR载体酶切和去磷酸化，用BsmBI在37℃酶切30min；
2.2 琼脂糖凝胶纯化酶切的LentiCRISPRv2载体
LentiCRISPR载体的大小为14,873bp，酶切后产生两个片段，一条大的为目的片段，小片段大小为1885bp。在LentiCRISPRv2载体中有两个BsmBI酶切位点，两个位点之间的片段为1885bp，酶切连接后sgRNA正好在U6启动子下游，连接后的sgRNA下游就是gRNA scaffold序列，与sgRNA一起转录出来发挥gRNA的引导功能。
2.3 磷酸化和Oligo退火成双链DNA；
反应条件如下：37℃ 30min → 95℃ 5min，然后按照5℃/min降温到25℃。
生工生物可以提供磷酸化修饰的引物，可以选择在Oligo的5’磷酸化修饰，就不需要用T4 PNK磷酸化Oligo链了。
2.4 稀释退火的Oligo链；
上一步退火后的双链DNA，按照1:200用水稀释。
2.5 双链Oligo与酶切的载体连接（室温连接10min）
2.6 转化到Stbl3细菌；进行后续筛选。
By
进哥哥
Tags:
CRISPR-Cas9
,
基因敲除
10X T4 Ligation buffer有的 我用的NEB的，单独包装的；
T4PNK磷酸化和后面的质粒去磷酸化其实讲道理可以不用，因为产生的粘性末端不一样，没有必要去磷酸化防止自连
要买的话其实随便一家就可以
您好！请问，得到的sgRNA的序列如果在反义链（antisense），那我在质粒上设计序列的时候应该把它放在正向序列上？还是反向序列上呢？另外，酶切位点暴露出的粘性末端是CACC，为什么要加上一个G变成CACCG呢？
不管你的sgRNA target哪个链，这与你构建治理没有关系，sgRNA是要在U6启动子下被转录出来，所以一定是要在正向上
加G的目的是因为U6启动子转录的偏好性，加一个G效率最高，当然如果sgRNA本身第一个碱基就是G，那就不需要，当然加了也没事
你好 不好意思 给刚看见 两个构建在一个里面需要另外再克隆一个启动子和gRNA序列进去，也就是两个sgRNA独立，不能直接串联；当然加在两个载体上也可以；两种差不多 一种前期构建麻烦一点 一种后期转染条件优化麻烦一点 效果一样
老师，请教一下，sgRNA启动子是U6，它是从G开始转录，所以转录出来的是和target配对的20个碱基，现在我把U6换成了其他的启动子,那么那么转录出来的gRNA 5’端就会多出来10个碱基，这个gRNA结合CAS9以后会自动修饰掉多出来的这10个碱基吗,如果没删除掉，这个gRNA还会识别靶基因吗
老师，选择的CRISPR-Cas骨架载体中U6 promoter 和sgRNA scaffold中间距离较近，（例如：载体pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0），中间没有酶切位点怎么处理呢？sgRNA 可以连接在sgRNA scaffold下游吗？期待您的回复，谢谢老师。
您好，当然不能在scaffold下游，我查了这个质粒说明书，
https://media.addgene.org/data/plasmids/62/62988/62988-attachment_KsK1asO9w4owD8K6wp8.pdf
酶切位点为：Bbsi，位于U6和scaffold之间，因为不是常见酶，一般不会默认标出来，你查看一下序列即可，建议使用snapgene软件
你好，不清楚你具体怎么构建的，拼装到一个载体上的话 四敲有各自的guide RNA和转录原件的话互不影响；单独四个载体的话也不会相互影响。多位点敲除我没有具体实施过，希望有机会可以继续探讨
感谢回答，我还有一个问题，靶点靠近终止子，而且这个靶点成功靶向，那么这个基因靶序列前面是照常翻译的，只在靠近终止子附近提前终止，这个结果算是被成功编辑吗？与靠近启动子的靶序列在结果上会有偏差吗？希望得到你的回复，谢谢
如果编辑成功，也是在终止子附近发生碱基随机缺失，这就有很多种可能性，缺失3的倍数的碱基就少相应的氨基酸，还是到原来的终止子位置停止；如果不是，就是移码突变，有可能提前终止 也有可能延后。
如你所说，终止子附近的突变可能对蛋白功能影响比较小，甚至没有影响，与你蛋白功能结构域相关。
如果启动子，一旦移码突变，蛋白完全改变。
so，你理解一下，尽量往上游设计
你好，请问下最近在做一个基因的CRISPR，目标基因长度在7k左右，有两个cds区，分别位于基因的前端与尾端附近，且这两个cds分别位于两个可变剪切上，但不清楚基因的功能到底是哪个cds发挥作用、共同作用或者都具有作用（有其他文献报道cds2突变会导致功能改变，但两个蛋白序列具有一定的差异）。在进行双靶或多靶crispr载体构建时（promoter-sgRNA1-promoter-sgRNA2-promoter-Cas9），若靶点只作用在cds1区域，会不会使cds2进行突变呢？
你好，你是在疑问设计了靶向其中一个CDS的gRNA，会不会影响另外一个吗？你设计的位点是基因的promotor区？如果这样的话，势必两个都会有影响，敲除影响的是整个基因的转录。
如果你是要分别研究两个CDS，可以分别在两个CDS靠近5‘端的位置设计gRNA。
另外您做双靶点切除是如何做？promoter-sgRNA1-promoter-sgRNA2-promoter-Cas9，我不太明白，我所知道的是如果连个sgRNA不在一个质粒上，那就是同时转染两个质粒，如果要在一个载体上，需要两个sgRNA分别有各自的promotor和cas9。
当然可能是我知识有限，还望可以一起讨论
您好，请问 如果设计的GRNA oligo是原目的基因的reverse端，那还是在forward端加CACC吗，还是应该以oligo 5‘端加cacc，互补链加 AAAC？拜托了
您好，sgRNA敲除载体构建时两端添加的是BsmBI酶切后的同源序列，目的是将oligo插入酶切后载体，与其位置无关。不管oligo target的位置是在正义链或反义链，都是一样在
oligo的5’端
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王 进（Jingle）
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