使用TCR-T的过继细胞治疗是一种有前景的癌症治疗方法，预计不会有明显的副作用。在人体内，成熟的T细胞具有多样性的TCR，理论上这些受体可以对肿瘤细胞产生的各种随机突变做出反应。然而，目前使用TCR-T细胞治疗的临床试验的结果并不是很成功，特别是在实体瘤方面。该疗法在有效筛选肿瘤特异性抗原及其同源TCR方面仍面临许多挑战。这里介绍基于TCR结构的抗原识别和信号转导，介绍新抗原及其特异性TCR筛选技术的最新进展，最后总结正在进行的针对新抗原的TCR-T治疗的临床试验。还介绍了基于TCR-T细胞的免疫治疗目前面临的挑战，例如病毒载体的安全性、TCR的错配，抑制性肿瘤微环境的阻碍。最后，强调了个性化TCR-T治疗的新见解和方向。

在肿瘤的发生和发展过程中，大量的基因异常，包括点突变、读码移位突变、终止密码子突变、DNA插入和缺失或染色体易位，在肿瘤细胞中积累，并产生许多突变的多肽和蛋白质。如果其中一些突变体被水解为短肽并通过MHC成功地呈递，则可以激活T或B淋巴细胞。这些免疫原性肽被称为新抗原。由于新抗原在正常组织中不表达，它们的特异性T细胞可以逃避胸腺的阴性选择，因此在具有治疗潜力的肿瘤患者中丰富。

基于TCR结构的T细胞激活

有必要在细胞和分子水平上了解TCR的结构和T细胞的激活，以充分了解如何启动最有效的抗肿瘤反应，为什么免疫反应无法消除肿瘤细胞，以及如何潜在地修改TCR的结构，使TCR-T细胞能够更好地杀伤肿瘤。

TCR 结构

在人类中有两种类型的TCR，即αβTCR和γδTCR，前者占主导地位。TCR是由一个抗原结合亚基(TCRαβ)和三个CD3信号亚基(CD3δε、CD3γε和CD3ζζ)组成的八聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链分别含有1个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，而CD3ζ链包含3个ITAM。整个TCR-CD3复合体总共包含10个ITAM (图1A)。这些ITAM中的酪氨酸磷酸化在TCR信号转导中起着重要作用。由Src家族激酶Lck磷酸化ITAM启动下游T细胞信号转导(图2)。因此，TCR-CD3复合物在发展新的TCR嵌合结构的同时保持结构完整。通过激活TCR复合物的胞外区，它可以激活T细胞并向下游传递信号。最近Enhancing the Antitumor Immunity of T Cells by Engineering the Lipid-Regulatory Site of the TCR/CD3 Complex报道了一种新的机制，即硫酸胆固醇(CS)与CD3ε的胞质结构域相互作用，以增强其与细胞膜的结合，并诱导稳定的二级结构。这种结构抑制了TCR的磷酸化和信号转导。当CD3ε的ITAM中引入点突变(I/A)时，它会降低二级结构的稳定性，消除CS介导的抑制并增强TCR复合物的信号。该研究首次通过揭示TCR/CD3复合信号的信号调控机制，实现了信号增强型TCR-T细胞的合理设计，为今后进一步提高免疫细胞在实体瘤中的疗效奠定了坚实的理论基础。

图1 TCR结构

图2 TCR信号转导中的新抗原呈递和调节机制。新抗原是由肿瘤细胞基因组突变产生的，被转录、翻译和切割成不同于正常自身蛋白的多肽。免疫原性新抗原肽与MHC分子(pMHC)结合，需要被TCR识别并启动免疫反应。TCR信号是由pMHC识别肿瘤细胞或抗原提呈细胞而启动的。然后，Lck被募集到TCR-CD3复合体上，使ITAM磷酸化。ZAP70与磷酸化的ITAM结合，并被Lck自身磷酸化。激活的ZAP70随后磷酸化LAT，进而诱导接头蛋白(GRB2、Gads、SLP-76、PLC-γ)的募集。LAT相关效应分子的激活通过3条主要的信号转导通路进行信号转导，钙调蛋白、MAPK和NF-кB信号通路。钙调蛋白信号转导导致NFAT的核易位。MAPK信号导致肌动蛋白聚合和FOS/JUN复合物转录因子AP-1的激活。NF-кB信号转导导致REL和NF-кB转录因子的核易位。

T 细胞活化

如果T细胞遇到APC中的pMHC并与之结合，TCR激活程序就会启动。TCR以免疫激酶(IK)或免疫突触(IS)的方式识别pMHC。Kinapse是一个暂时性和不稳定的结构，而Synapse是长期稳定的。T细胞的激活和信号传递依赖于TCR与pMHC的持续接触。T细胞的充分激活需要三个信号：一种是TCR-pMHC复合物介导的抗原特异性信号；另一种是CD28-B7(CD80、CD86)等共刺激信号；细胞因子充当第三信号，在激活的T细胞中提供细胞增殖和生存信号。因此，增强共刺激信号或增加细胞因子的作用是改善TCR-T细胞功能的另一种方法。

重组TCRs

众所周知，CAR-T细胞疗法利用一种能够识别癌细胞表面特定抗原的合成受体，如CD19。由于其固有的高度特异性，CAR-T细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤如急性淋巴细胞白血病方面取得了成功，但在实体瘤中的疗效有限。与CAR-T的单一受体不同，TCR-T免疫疗法使用天然TCR来识别特定的肿瘤抗原。在这个识别过程中，T细胞的激活更具选择性和调节性，从而降低了过度激活和细胞因子释放的风险。然而，在实践中，肿瘤中经常会发生抗原丢失和MHC分子下调。此外，由于MHC类型的个体性，TCR-T治疗的同种异体应用受到限制。为了克服这些局限性，TCR结构修饰以提高免疫治疗效率的研究取得了快速进展，如STAR、AbTCR、ImmTAC等(图1B)。

STAR-T结合了CAR-T和TCR-T的优点，是一种不依赖MHC的高亲和力TCR-T。STAR是一种抗体-TCR嵌合体，其TCR恒定区与抗体的重链和轻链可变区相连。为了维持天然的TCR信号，可以在TCR的恒定区和胞内区进行基因突变和功能元件的添加。例如，可以将人TCR恒定区hSTAR优化为mutSTAR，该mutSTAR具有高亲和力、高特异性和MHC不受表面抗原的限制。T细胞受体融合结构(TRuC)是由一个基于抗体的结合域(scFv)与TCR亚基融合而成，它可以通过重新编程TCR复合体来有效识别肿瘤表面抗原，并独立于MHC杀伤肿瘤细胞。TCR mimic (TCRm)抗体已被证明能够模拟TCR对肽/MHC I类复合体的特异性，并介导抗体依赖的细胞毒性。Validation and promise of a TCR mimic antibody for cancer immunotherapy of hepatocellular carcinoma构建了一种识别AFP/HLA-A*02复合体的新型TCRm抗体，该抗体具有TCR功能，可靶向肝癌细胞内抗原。Fab片段与TCR的γ和δ亚基融合，形成能够传递信号的抗体-TCR(AbTCR)结构。同时，构建了针对GPC-3的scFv/CD28共刺激分子。通过慢病毒载体将AbTCR和共刺激分子导入T细胞。通过AbTCR信号和CD28共刺激信号促进T细胞的增殖和激活。此外，ImmTAC是一种双功能试剂，它结合了可溶性TCR与细胞内或细胞外肿瘤特异性抗原和抗CD3 scFv抗体的亲和力。这些ImmTAC将T细胞定向到呈递靶标多肽-MHC复合体的肿瘤细胞。IMCgp100是一种识别来自黑色素瘤特异性蛋白gp100多肽的ImmTAC，有效地重定向和激活CD8+和CD4+T细胞的效应细胞和记忆细胞，可诱导广泛的免疫反应。

新抗原和同源TCR预测及筛查策略

新抗原肽与MHC结合的计算预测

发生免疫反应的基本前提是突变的多肽有效地结合到MHC分子上并由MHC分子呈递，从而引发强大的免疫反应。因此，预测MHC分子与多肽结合的概率是当前计算中的关键步骤。已发表的MHC结合亲和力预测算法将配体数据集整合到机器学习算法中，并利用ROC曲线来评估多肽结合或呈递的可能性，包括NetMHC 4.0、MHCflurry、MixMHCpred等。NetMHCpan是一种先进的MHC结合亲和力预测算法，它使用MHC配体的亲和力测量和MS洗脱数据进行训练。通过利用与特征良好的MHC等位基因的同源性，该算法推断潜在的配体偏好，确保其与其他预测工具相比的稳健性和有效性。

新的研究强调了抗原特异性的CD4+和CD8+T细胞之间的协同作用在抗肿瘤免疫中的重要作用。因此，为了有效的抗肿瘤免疫反应，应该考虑能够与个体患者的MHC-II等位基因结合的新表位。人工神经网络已被广泛用于开发MHC-II结合表位的预测工具，包括NetMHCII、NetMHCIIPan、SMMAlign和NNalign用于预测MHC-II结合肽(表1)。事实上，与I类工具的准确性相比，MHC-II呈递的新抗原预测仍然具有挑战性。首先，MHC-II的多肽结合槽相对较浅且两侧开放，导致结合肽(9-22个残基)的长度差异很大。其次，MHC-II分子中α和β链的多态性进一步扩大了多肽结合特异性的多样性。第三，关于MHC-II类分子有效结合的数据是有限的，这使得准确训练和验证预测模型具有挑战性。鉴于没有一种预测工具在所有多肽长度和所有HLA类别上都始终如一地表现良好，一些预测工具可以同时结合不同的算法来预测MHC分子的结合呈递，从而提高整体性能。

表1 新抗原预测和筛选的当前计算pipeline

TCR-pMHC 结合的计算预测

近年来，新抗原预测已经从仅仅关注抗原肽转向它与TCR的相互作用(表2)。先前研究发现TCR序列的长度和TCR CDR3内的精氨酸数量都会影响T细胞识别。有研究提出了一种新的策略，用其表位结合的特异性来注释完整的TCR库，并在三个独立的数据集中进行了验证。接种疫苗后抗原特异性TCR谱系增加。人工智能在蛋白质结构预测中的应用可以有效地利用序列和结构信息来构建新型的深度学习网络结构。基于自然语言处理(NLP)的方法可用于从大规模库中预测TCR结合肽。有研究构建了ERGO-AE和ERGO-LSTM模型，分别使用自动编码器(AE)和长短期记忆(LSTM)进行训练。有研究提出一种新的相互作用图识别(ImRex)方法，可用于预测以前未见过的表位，ImRex在已知表位上表现出了卓越的性能，并显示出比标准双输入方法更能推断出与训练数据更相似的表位的能力。上述所有模型都只能支持多肽和TCRβ链序列。然而，TCR的α链也有助于结合特异性。哈尔滨工业大学蒋庆华教授课题组开发的模型DLpTCR，它是用TCR的单链/成对链和多肽相互作用预测的集成深度学习构建的。此外，MHC蛋白也应该包括在表位预测中，因为它们被认为影响表位锚定位置的空间位置。

表2 目前可用的TCR-表位结合预测方法

为了发现T细胞激活的未知结构驱动因素并设计新的多肽配体和疫苗，了解TCR-pMHC空间构象的多肽结合细节是重要的。不幸的是，在蛋白质数据库中只有少数pMHC复合体和TCR-pMHC的3D结构。缺乏关于给定肽的共同结合部位和方向的信息，以及其在TCR-pMHC复合体中的正确对接仍然是预测结构建模方法的重大挑战。虽然人工智能工具Alphafold2提供了卓越的蛋白质结构预测，但其对TCR-pMHC结合构象的预测准确性需要进一步验证。

新抗原预测的综合途径

通常，新抗原的预测始于从肿瘤样本的全外显子组/基因组测序中鉴定所有体细胞突变。然而，并不是所有的突变都能产生有效的新抗原产物。为了识别能够激活T细胞的新抗原，新抗原的预测需要考虑一些因素，如突变类型、蛋白酶体降解、与抗原处理相关的转运蛋白(TAP)、HLA分子结合和递呈以及TCR的识别潜力(图2)。现有的新抗原预测的经典完整工作流程可概括为以下几个步骤：①对PBMC或正常组织和肿瘤组织进行全外显子测序(WES)，以鉴定肿瘤特异性突变肽；②通过外周血细胞中的RNA-seq或DNA-seq分析HLA分型；③预测突变肽与MHC分子之间的亲和力；④优先考虑候选肽的TCR识别。目前，已经为每一步建立了许多有价值的生物信息学工具，因此利用各种算法工具的组合，可以确定影响新表位选择和优先顺序的关键参数。这样的最佳组合可以形成有效的新抗原预测的综合管道(图3)，如TSNAD，TIminer，MuPeXI，Neo-Fusion和pVACtools等。一些预测的新抗原表位在临床试验中显示出有希望的结果 (表1)。例如，1例胶质母细胞瘤患者接种由pVAC-seq预测管道(NCT02510950)生产的合成8个氨基酸多肽(SLP)疫苗，接种后用IFN-γ ELISPOT在外周血中检测到3个HLA-I和5个HLA-II限制性肿瘤抗原。用MuPeXI检测了6例肾透明细胞癌患者外周血中52种诱导CD8+T细胞特异性反应的新抗原。OpenVax可以生产用户指定长度的SLP，3种具有长突变多肽的SLP疫苗已分别在I期临床试验中进行测试(NCT02721043、NCT03223103和NCT03359239)。

图3 新抗原计算预测和筛选管道的工作流程。

综合分析基因组学和蛋白质组学，蛋白质基因组学在理论上可能更准确地识别癌细胞体细胞突变的真正基因组到蛋白质组的变化。其中，基于MS的方法被认为适合于直接分析实际呈现的免疫肽，提供针对仅根据基因组学数据预测的HLA结合新抗原的蛋白质水平验证。结合质谱数据使预测算法和预测管道更加多样化，预测新肽的输出列表更短但更可靠，例如使用NeoFlow，ProGeo-neo(表1)。蛋白质组学方法的进步不仅扩展了来自编码区的新抗原的新抗原预测管道，还有助于产生非编码新抗原预测管道，如PGNneo。

新抗原的计算筛选策略

到目前为止，新抗原仍然是通过计算预测的。在TCR-T相关免疫治疗中，进一步的筛选方法对于识别具有更大潜力产生免疫反应的新抗原是至关重要的。这种筛选可能是计算性的，也可能是实验性的。已发现免疫原性特征与T细胞激活有关，包括序列相似性、多肽熵、肽结合残基、氨基酸的理化性质、分子结构和序列长度。将这些潜在的免疫原性特征整合到新抗原计算的管道中，可以更准确地评估已识别的新抗原的免疫治疗效果。计算筛选策略包括数据筛选和算法筛选策略(图3)。计算过滤/筛选包括三个层次：过滤1基于RNA表达；过滤2基于质谱鉴定；过滤3基于数据库高置信度BLAST搜索。序列相似性高于规定阈值的新抗原更有可能具有免疫原性。算法筛选涉及三个层次：抗原结合；新抗原肽表位-TCR识别；免疫原性计算，对预测多肽进行优先排序，筛选出TCR可以识别的新抗原。计算筛选策略或多或少地嵌入了几乎所有上述新抗原预测管道中，这样的筛选可能会缩小候选新抗原的列表，以进行进一步的真正的实验验证，并有助于提高临床试验的成功。

新抗原的实验筛选策略

准确评估新抗原在免疫治疗中的潜力并通过实验验证其与T细胞的反应性仍然是临床选择的金标准。T细胞与负载不同潜能多肽的自体APC共培养是检测肿瘤抗原反应性的最直接方法。目前，潜在的多肽以串联微基因(TMG)或长肽的形式同时引入细胞中，以提高筛选效率。虽然这两种方法成功地用于各种实体肿瘤的临床研究，包括结直肠癌、黑色素瘤和肺癌，但由于它们需要多轮筛查来识别反应性肿瘤抗原，因此费时费力。结合使用高度多样化的酵母展示多肽-MHC文库和深度测序，极大地扩大了识别表位的数量。或者，多肽可以被基因编码并以杆状病毒文库中的pMHC复合物的形式显示在细胞表面。例如，通过将pMHC复合物与杆状病毒gp64分子的跨膜区融合，将其锚定在Sf9细胞膜上。APC的工程化可以进一步提高新抗原的筛选效率。Sensitive identification of neoantigens and cognate TCRs in human solid tumors开发了一种名为Neoscreen的方法，基于TIL与CD40激活的(CD40-act) B细胞的接触，优化了抗原验证的灵敏度。CD40-act B细胞表达抗原提呈和T细胞活化所需的关键分子，如IL-2、OX40L和4-1BBL。而CD40-act B细胞负载不同来源的新抗原(即，转染TMG或合成多肽)，确保了体外有效刺激新表位特异性CD8 TIL。最近，Identification of patient-specific CD4+ and CD8+ T cell neoantigens through HLA-unbiased genetic screens提出了一种高通量的遗传系统，用于个性化鉴定CD4+和CD8+T细胞识别(neo)抗原，在这种被称为HANSolo (HLA不可知新抗原筛选)的方法中，构建患者匹配的Bcl-6/xL永生化B细胞系以表达用于筛选T细胞抗原的大量微基因文库。这种方法提供了更高的灵敏度，特别是在发现由CD4+T细胞识别的新抗原时，同时使通量显著增加。随着单细胞RNA测序和TCR测序技术的发展，使得从血液或肿瘤组织中获得TCRαβ配对变得更加容易。因此，更多具有不同生物学机制的平台被用来发现TCR配体。T cell antigen discovery via trogocytosis开发了一个基于细胞的选择平台，通过利用一种称为巨噬细胞增多的膜转移现象来发现T细胞抗原。当T细胞将NHS-生物素标记的表面蛋白转移到同源靶细胞时，后者可以通过流式细胞术进行鉴定和分选用于肽序列测序。此外，一个称为信号和抗原提呈双功能受体(SABRs)的嵌合受体群为TCR配体的发现提供了第二个基于细胞的平台。SABR的胞外区可以共价连接到多肽-β2M-MHC三聚体，该三聚体进一步与细胞内的CD3ζ信号转导结构域融合，在与TCR相互作用后，呈递同源抗原的SABR在收到CD3ζ信号后将在NFAT-GFP-Jurkat细胞中诱导GFP表达。此外，T-Scan是一种高通量筛选TCR识别抗原的方法，它使用慢病毒递送抗原库，并在MHC分子上进行内源性处理和呈递。使用颗粒酶B活性报告基因分离T细胞功能识别的靶细胞，然后通过NGS测序鉴定介导识别的抗原(图4)。

图4 新抗原和同源TCR发现技术的示意图概述和验证。最后，通过新表位四聚体/4-1BB染色、IFN-γ ELISPOT、肿瘤杀伤活性、脱颗粒等多项筛选实验验证T细胞对新抗原的识别。同时，以CXCL13、ENTPD1(CD39)、CD200等为特征的T细胞可快速克隆新抗原特异性TCRs。详细可见《快速实现个体化TCR-T细胞治疗》和《抗肿瘤新抗原反应性T细胞的分子特征》。

新抗原反应性TCR筛选的实验策略

在新抗原特异性TCR的筛选中，pMHC四聚体和4-1BB染色被广泛应用于多种肿瘤。四聚体可以同时识别多种抗原特异性T细胞，但由于其复杂的合成技术，MHC的类型有限。有研究使用分子伴侣TAPBPR稳定捕获四聚化的空MHC-I分子，这些分子可以高通量地容易地负载感兴趣的多肽。同时，用DNA条形码和多重荧光染料标记四聚体在一次筛选中显著增加了抗原种类。虽然IFN-γ ELISPOT和细胞毒活性被广泛用于检测反应性T细胞群，但在单细胞水平上缺乏对新抗原的敏感性。一些特殊的生物传感器，如FRET、荧光NFAT和H2B组蛋白传感器，已经被设计来检测TCR的激活。然而，这些信号在TCR筛选中的特异性仍然值得怀疑。一种名为FucoID的化学酶平台被开发出来，将岩藻糖基转移酶锚定在DC的表面，当DC与同源TCR相互作用时，GDP-岩藻糖基化生物素底物中的生物素可以转移到T细胞表面，使TIL中的TSA反应性T细胞与旁观者T细胞区分开来。此外，基于微流控的筛选系统被用来将单个TCR-T细胞和单个靶细胞与NFAT/AP-1调节的eGFP包裹在一个孔中，如果TCR-T细胞与其同源抗原相互作用，可在显微镜下观察到荧光变化(图4)。

由于传统的TCR-T开发过程耗时长、效率低，可能不适合个性化治疗。在scRNA-seq、TCR-seq、CITE-seq等技术的帮助下，研究人员能够使用CXCL13、ENTPD1(CD39)和CD200肿瘤新抗原特异性T细胞的高频分子特征来快速全面地表征各种肿瘤中的T细胞，直接从患者身上获得新抗原特异性TCR可以极大地加速个性化T细胞治疗，详细研究内容可见《快速实现个体化TCR-T细胞治疗》和《抗肿瘤新抗原反应性T细胞的分子特征》。例如，中山大学肿瘤防治中心周鹏辉教授团队已经建立了一套完整的TCR快速克隆技术平台和I期(NCT03891706)个性化TCR-T治疗，如下视频。

所有这些策略都基于不同的原理，为筛选肿瘤新抗原反应性T细胞提供了创造性的工具。

新抗原TCR-T治疗的临床试验

突变新抗原比TAA或肿瘤病毒抗原具有更大的个体差异和更少的潜在表位。即使同一肿瘤不同个体中不同类型和不同数量的新抗原因突变的特异性而表现出明显的个体异质性。越来越多的基于新抗原的TCR-T临床试验使用癌基因或抑癌基因的热点突变，例如，针对KRAS G12D和KRAS G12V变种的高亲和力TCR已经被成功研究。经突变的KRAS G12D和KRAS G12V体外刺激后，在6例转移癌中有3例检测到CD4+和CD8+记忆性T细胞。研究报道了一例难治性复发性胰腺癌患者单次输注KRAS G12D的TCR-T治疗的益处，虽然患者对手术、新辅助化疗和自体TIL治疗无效，但在使用HLA-C*08:02限制性TCR-T细胞治疗6个月以上后，内脏转移灶消退。同样，P53突变体，如R175H、Y220C和R248W也具有免疫原性，可被T细胞识别。有报道163例转移性实体瘤患者中有97例存在P53基因非同义突变，21例突变型TIL中有39个TCR升高，其中2例在P53突变型反应性TIL治疗4个月和6个月后有部分缓解。用p53 R175H的同种异体HLA-A*02限制性TCR预转导的自体外周血淋巴细胞治疗，化疗难治的乳腺癌患者的免疫表型得到改善，肿瘤客观消退(~55%)，生存期延长6个月以上。弥漫性中线胶质瘤(DIPG)是一种儿童脑干侵袭性肿瘤，目前尚无有效治疗方法。大多数DIPG通常在组蛋白3变体3的第27位(H3.3 K27M突变)含有从赖氨酸到蛋氨酸的氨基酸替换，这会破坏二价染色质结构域并驱动神经干细胞特异性胶质瘤形成。成功构建识别H3.3 K27M的HLA-A*02:01-限制性TCR-T，过继转移这些TCR-T细胞显著抑制了小鼠脑胶质瘤异种移植瘤的进展。在胶质瘤患者中使用TCR-T细胞靶向H3.3 K27M的早期临床研究(NCT05478837)已经启动(表3)。同时，一些针对不同实体瘤不同个体的个性化新抗原TCR-T的临床试验也在招募和进行中，如NCT05194735、NCT03412877。针对多个靶点的几种个性化疗法也在开发中，在化疗耐药的HR阳性的转移性乳腺癌中，通过RNA测序和针对突变的SLC3A2、KIAA0368、CADPS2和CTSB的过继TIL转移以及IL-2和检查点阻断，在22个月内肿瘤完全消退。目前，针对1-5种新抗原(NCT05349890)的工程TCR-T细胞的临床试验正在使用PD-1抑制剂和CD4激动剂(表3)。尽管大多数TCR-T研究仍处于临床前阶段，但它对具有肿瘤特异性突变的癌症患者显示出巨大的潜力。

此外，对单核苷酸变异(SNV)、移码抗原、剪接变异、基因融合和内源性逆转录元件进行了评估(表1)。针对非编码基因衍生多肽的几种个性化疗法也正在开发中，作为新抗原的替代来源。

表3 针对新抗原的工程TCR-T细胞临床试验(截至2023年7月17日)

新抗原TCR-T治疗面临的挑战

肿瘤异质性

肿瘤内异质性(ITH)，即肿瘤内亚克隆细胞群体的克隆多样性。ITH水平越高的肿瘤，其抗肿瘤免疫反应越弱，更易发生进展。在更多的异质性肿瘤细胞群体中，肿瘤细胞可能有更好的机会逃脱免疫监视，因为反应性新抗原相对于其他新抗原在肿瘤内经历了“稀释”。一方面，这导致了更复杂的新抗原预测进展，TIL中新抗原特异性T细胞的频率较低。另一方面，随着肿瘤的进展或靶向免疫治疗后，某些亚克隆群体中MHC-I/II分子的抗原丢失和下调经常发生。同时，细胞毒性T细胞丧失了杀死肿瘤细胞的能力，这些肿瘤细胞是抗原呈递过程中的缺陷。然而，这意味着针对单个靶点的TCR-T疗法在杀伤肿瘤方面可能并不有效。

在TCR-T治疗中有一些针对ITH的策略。溶瘤病毒、化疗药物和放疗可导致免疫原性细胞死亡(ICD)。肿瘤细胞的裂解可以在TME内释放大量的抗原和细胞因子，从而激活有效的多表位免疫反应。在TCR-T靶点选择时，由驱动基因热点突变编码的新抗原可能是优先考虑的，这种抗原通常是肿瘤进展所必需的，不太容易自然丢失。此外，对天然的TCR结构进行修改，以克服MHC分子的下调。与经典的αβT细胞不同，γδT细胞并不局限于pMHC，表达的NKR可以识别在许多肿瘤类型中上调的应激抗原。γδ T cells are effectors of immunotherapy in cancers with HLA class I defects研究表明γδT细胞是DNA错配修复缺陷型(MMR-d)肿瘤免疫治疗的效应细胞，B2M失活突变可激活γδT细胞。此外，这些γδT细胞主要由Vδ1和Vδ3亚型组成，具有很强的杀伤活性。这些研究表明，γδT细胞可能适合于治疗MHC缺陷性肿瘤，并可用于同种异体细胞治疗。

新抗原预测准确性的局限性

鉴定新抗原的过程不断发展和完善，并在临床试验中得到了广泛应用。但是，开发一种精确而强大的鉴定新抗原的管道往往是复杂的，需要高质量的DNA/RNA测序数据和相应的质谱数据，以及对高精度算法的严格测试和培训。既往研究表明，只有约1%的突变会产生新抗原，从而引发自发的TIL反应。T细胞可能无法识别足够新抗原的原因之一是突变多肽和野生多肽之间的相似性，以及由中枢或外周耐受机制诱导的功能性TCR库之间的相似性。此外，目前开发的新抗原预测管道缺乏特定的预测工具来支持SNV和插入缺失以外的新抗原预测，如RNA剪接和转录组选择性剪接。目前，新抗原预测的准确率不到50%。因此，如何快速验证所预测的肿瘤表位是否为临床适用的新抗原，在不久的将来仍将是一个瓶颈。

递送系统

目前，大多数工程化的TCR是由慢病毒递送的，其生物安全性在患者中并不完全了解。由于它在染色体中的随机整合，可能会发生插入突变、脱落和免疫原性，导致T细胞中基因表达缺陷甚至癌基因激活。因此，寻找更有效、更安全的载体来代替慢病毒是至关重要的。通过分子剪切和粘贴机制，睡美人(SB)转座系统已被用于识别反向末端重复序列(ITRs)的特定位点遗传操作。一项SB修饰的CAR-T细胞治疗B细胞恶性淋巴瘤的临床试验已经报道。用SB转座子系统构建的TCR-T细胞在肿瘤细胞系中诱导对突变新抗原的免疫反应。SB修饰的特异性TCR具有成本低、生产速度快、无病毒载体、生物安全性高等优点，在个性化T细胞免疫治疗中具有良好的应用前景(表3)。CRISPR/Cas9和核酸酶等其他技术也在尝试作为TCR-T构建的非病毒载体。

然而，体外定制工程T细胞的复杂性以及由此导致的T细胞活性和有效性的降低可能会阻碍扩展到不同类型的肿瘤和不同的患者群体。研究人员发现，结合纳米技术方法可以帮助缓解TCR或共刺激信号传递方面的这些限制。多功能纳米颗粒可以直接调节受体簇，以提高TCR的递送效率，同时减少off-target毒性。《特异性CAR或TCR mRNA-纳米颗粒-T细胞的重复输注可消退疾病》证明了使用可生物降解的聚合物纳米载体在体外转录CAR或TCR mRNA，用于瞬时重新编程循环T细胞以识别与疾病相关的抗原。有研究表明，通过将pMHC呈递给相关的TCR，利用磁性纳米颗粒载体增强抗原特异性T细胞的强度，可以刺激抗肿瘤活性。此外，纳米技术可以实现高载药量和肿瘤部位的受控给药。例如，基于蛋白质的纳米凝胶颗粒(NGs)，它可以精确控制细胞因子的释放，并选择性地激活TME中的免疫细胞。这些NGs的功能就像“纳米级背包”，由许多与自身交联的蛋白质拷贝组成(自组装纳米颗粒)，从而实现无载体的细胞因子递送，从而提高疗效和安全性。此外，最近发展的几种基于纳米材料的策略可以控制免疫调节剂的纳米分布并调节T细胞的行为，如仿生修饰纳米颗粒、可变形纳米颗粒、光热效应纳米颗粒、刺激响应纳米颗粒等。通过纳米技术将药物递送与TCR激活联系起来，在肿瘤免疫治疗领域中有望实现基于T细胞的免疫治疗。

TCR 错配

大多数T细胞表达αβ受体，少数表达γδ受体。当T细胞与外源性αβ受体进行工程时，外源性和内源性α/β链之间可能会出现不匹配的TCR，反之亦然。在小鼠研究中，给TCR-T细胞注入错配的新型TCR可能会导致严重的GVHD。此外，外源性TCRs、内源性TCRs和错配的TCRs将与CD3分子竞争T细胞信号，导致外源性TCR表达减少，T细胞激活效率低下，T细胞毒性降低。

CRISPR/Cas9已被用于编辑TRAC和TRBC基因座敲除内源α和β编码基因，并增加外源TCR的表达。一项临床前研究显示，使用这些修饰的T细胞可以增强多发性骨髓瘤的T细胞识别能力，并延长肿瘤负担的小鼠的生存时间。最近，一种临床级别的方法，即使用CRISPR/Cas9系统敲除内源性TRAC和TRBC基因，并将转基因新抗原特异性TCR(neo TCR)插入到TRAC基因座中。neoTCR-T细胞的剂量递增目前在I期临床试验(NCT0370382)启动。

将αβTCR引入γδT细胞可以显著减少TCR配对错误。在TCRαβ转移的γ4δ1 T细胞中，没有发现γδTCR与αβTCR的错配，也没有发现正常细胞的细胞毒活性。此外，人TCR的恒定区可以被小鼠的恒定区取代。此外，引入半胱氨酸突变，通过二硫键稳定整个TCR受体，从而降低与内源性TCRα/β链的结合亲和力。

免疫抑制肿瘤微环境

TME已被证实不仅在肿瘤的发生和发展中起着关键作用，而且在T细胞的增殖和功能中也起着关键作用。TME中T细胞功能障碍往往导致TCR-T治疗失败。因此，重塑免疫微环境是提高免疫治疗疗效的重要策略。在TCR-T治疗过程中应特别考虑以下因素：

（1）趋化因子

增强免疫反应细胞的趋化性及其信号转导是TME重塑的主要策略。高表达的CXCL9/10/11可能有助于影响T细胞向肿瘤组织的迁移和浸润。上调CXCR2可以促进TCR-T细胞向肿瘤组织的迁移。趋化因子-抗体融合蛋白通过直接靶向肿瘤细胞的趋化因子，增强效应T细胞在肿瘤内的募集。例如，构建靶向CXCL10-EGFRvIII scFv的胶质瘤融合蛋白，并与肿瘤抗原特异性CD8+T细胞结合进行测试。有研究用溶瘤单纯疱疹病毒1型(oHSV)制备OV-Cmab-CCL5，其中EGFR抗体(cetuximab)的可分泌单链可变区通过Fc旋钮入孔策略连接到CCL5上。由于在TME中持续产生CCL5，OV-Cmab-CCL5显著增强了NK细胞、巨噬细胞和T细胞的迁移和激活。趋化因子的协同作用可提高TCR-T细胞的临床治疗效率。

（2）代谢物

TME中的代谢产物具有调节抗肿瘤免疫反应的作用。最近报道IDH突变的肿瘤代谢产物D-2HG可抑制CD8+T细胞介导的肿瘤细胞毒作用，在TME中过量积累D-2HG会抑制乳酸脱氢酶(LDH)活性和葡萄糖代谢，从而损害CD8+T细胞的激活、增殖和细胞毒性。有报道肿瘤细胞富马酸水合酶(FH)的突变或缺失使肿瘤间质积聚了富马酸，通过在C96和C102位点琥珀化ZAP70而破坏TCR信号传导，从而抑制了CD8+T细胞的抗肿瘤反应。在异种移植肿瘤模型中，通过FH再表达去除富马酸显著增强了抗CD19 CAR-T的效率。因此，调控TME中的肿瘤代谢物可能是提高肿瘤免疫治疗水平的重要策略。由于代谢物众多且动态，很难确定哪一种最适合TME重塑。

（3）检查点分子

免疫检查点是指能够积极或消极地调节T细胞活化的受体和相应的配体。例如，CD40在包括抗原提呈细胞在内的多种免疫系统细胞中表达，其配体CD40L在激活的T细胞表面瞬时表达。CD40/CD40L信号允许DC成熟，然后触发T细胞的激活和分化。活化T细胞中的抑制受体如PD-1、CTLA-4分别与肿瘤细胞或基质细胞中的PD-L1、CD80/86相互作用，传递免疫抑制信号，诱导T细胞凋亡，抑制T细胞功能。一项临床试验(NCT05349890)已经开始确定针对TSA的过继TCR-T转移联合CD40(CDX-1140)和PD-1(pembrolizumab)的安全性和客观反应。已经出现一些阻断PD-L1/LAG-3和其他靶点(例如PD-1/VEGF)的双特异性抗体。当然，还需要更多的临床试验来探索这些调节剂在不同组合中的疗效和副作用。

总结

新抗原及其特异性TCR库的发现是TCR-T免疫治疗成功的关键步骤。随着组学研究技术的进步，通过实验和生物信息学分析，越来越多的新抗原可用于个性化免疫治疗。新抗原及其同源TCR筛查的计算预测和实验验证相结合的策略因其省时、高效和临床实用而受到鼓励。肿瘤异质性和肿瘤免疫抑制微环境仍然是基于新抗原的TCR-T治疗在较长时间内的两个主要挑战。最后，TCR-T细胞与其他疗法的结合应该是未来的正确方向。

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