Bwa比对步骤大致如下：

（1）对参考基因组构建索引：

例子：bwa index -a bwtsw hg19.fa。最后生成文件：hg19.fa.amb、hg19.fa.ann、hg19.fa.bwt、hg19.fa.pac和hg19.fa.sa。

构建索引时需要注意的问题：bwa构建索引有两种算法，两种算法都是基于BWT的，这两种算法通过参数-a is 和-a bwtsw进行选择。其中-a bwtsw对于短的参考序列是不工作的，必须要大于等于10Mb；-a is是默认参数，这个参数不适用于大的参考序列，必须要小于等于2G。

（2）寻找输入reads文件的SA坐标。

对于pair end数据，每个reads文件单独做运算，single end数据就不用说了，只有一个文件。

例子： pair end：

bwa aln hg19.fa read1.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I > read1.fq.gz.sai

bwa aln hg19.fa read2.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I > read2.fq.gz.sai

single end：

bwa aln hg19.fa read.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I > read.fq.gz.sai

主要参数说明：

-o int：允许出现的最大gap数。

-e int：每个gap允许的最大长度。

-d int：不允许在3’端出现大于多少bp的deletion。

-i int：不允许在reads两端出现大于多少bp的indel。

-l int：Read前多少个碱基作为seed，如果设置的seed大于read长度，将无法继续，最好设置在25-35，与-k 2 配合使用。

-k int：在seed中的最大编辑距离，使用默认2，与-l配合使用。

-t int：要使用的线程数。

-R int：此参数只应用于pair end中，当没有出现大于此值的最佳比对结果时，将会降低标准再次进行比对。增加这个值可以提高配对比对的准确率，但是同时会消耗更长的时间，默认是32。

-I int：表示输入的文件格式为Illumina 1.3+数据格式。

-B int：设置标记序列。从5’端开始多少个碱基作为标记序列，当-B为正值时，在比对之前会将每个read的标记序列剪切，并将此标记序列表示在BC SAM 标签里，对于pair end数据，两端的标记序列会被连接。

-b ：指定输入格式为bam格式。

bwa aln hg19.fa read.bam > read.fq.gz.sai

（3）生成sam格式的比对文件。如果一条read比对到多个位置，会随机选择一种。

例子：single end：bwa samse hg19.fa read.fq.gz.sai read.fq.gz > read.fq.gz.sam

-n int：如果reads比对次数超过多少次，就不在XA标签显示。

-r str：定义头文件。‘@RG\tID:foo\tSM:bar’，如果在此步骤不进行头文件定义，在后续 GATK 分析中还是需要重新增加头文件。

pair end：bwa sampe -a 500 read1.fq.gz.sai read2.fq.gz.sai read1.fq.gz read2.fq.gz > read.sam

-a int：最大插入片段大小。

-o int：pair end两reads中其中之一所允许配对的最大次数，超过该次数，将被视为

single end。降低这个参数，可以加快运算速度，对于少于30bp的read，建议降低-o值。

-r str：定义头文件。同single end。

-n int：每对reads输出到结果中的最多比对数。

对于最后得到的sam文件，将比对上的结果提取出来（awk即可处理），即可直接用于GATK的分析。

注意：由于GATK在下游的snpcalling时，是按染色体进行callsnp的。因此，在准备原始sam文件时，可以先按染色体将文件分开，这样会提高运行速度。但是当数据量不足时，可能会影响后续的VQSR分析，这是需要注意的。

2. 对sam文件进行进行重新排序（reorder）

由BWA生成的sam文件时按字典式排序法进行的排序（lexicographically）进行排序的（chr10，chr11…chr19，chr1，chr20…chr22，chr2，chr3…chrM，chrX，chrY），但是GATK在进行callsnp的时候是按照染色体组型（karyotypic）进行的（chrM，chr1，chr2…chr22，chrX，chrY），因此要对原始sam文件进行reorder。可以使用picard-tools中的ReorderSam完成。

java -jar picard-tools-1.96/ReorderSam.jar

I=hg19.sam

O=hg19.reorder_00.sam

REFERENCE=hg19.fa

1) 这一步的头文件可以人工加上，同时要确保头文件中有的序号在下面序列中也有对应的。虽然在GATK网站上的说明chrM可以在最前也可以在最后，但是当把chrM放在最后时可能会出错。

2) 在进行排序之前，要先构建参考序列的索引。

e.g. samtools faidx hg19.fa。最后生成的索引文件：hg19.fa.fai。

3) 如果在上一步想把大文件切分成小文件的时候，头文件可以自己手工加上，之后运行这一步就好了。

3. 将sam文件转换成bam文件（bam是二进制文件，运算速度快）

这一步可使用samtools view完成。

e.g. samtools view -bS hg19.reorder_00.sam -o hg19.sam_01.bam

4. 对bam文件进行sort排序处理

这一步是将sam文件中同一染色体对应的条目按照坐标顺序从小到大进行排序。可以使用picard-tools中SortSam完成。

java -jar picard-tools-1.96/SortSam.jar

INPUT=hg19.sam_01.bam

OUTPUT=hg19.sam.sort_02.bam

SORT_ORDER=coordinate

5. 对bam文件进行加头（head）处理

GATK2.0以上版本将不再支持无头文件的变异检测。加头这一步可以在BWA比对的时候进行，通过-r参数的选择可以完成。如果在BWA比对期间没有选择-r参数，可以增加这一步骤。可使用picard-tools中AddOrReplaceReadGroups完成。

java -jar picard-tools-1.96/AddOrReplaceReadGroups.jar

I=hg19.sam.sort_02.bam

O=hg19.reorder.sort.addhead_03.bam

ID=hg19ID

LB=hg19ID

PL=illumine

PU=hg19PU

SM=hg19

ID str：输入reads集ID号；LB：read集文库名；PL：测序平台（illunima或solid）；PU：测序平台下级单位名称（run的名称）；SM：样本名称。

注意：这一步尽量不要手动加头，本人尝试过多次手工加头，虽然看起来与软件加的头是一样的，但是程序却无法运行。

6. Merge

如果一个样本分为多个lane进行测序，那么在进行下一步之前可以将每个lane的bam文件合并。

java -jar picard-tools-1.70/MergeSamFiles.jar

INPUT=lane1.bam

INPUT=lane2.bam

INPUT=lane3.bam

INPUT=lane4.bam

INPUT=lane8.bam

OUTPUT=sample.bam

7. Duplicates Marking

在制备文库的过程中，由于PCR扩增过程中会存在一些偏差，也就是说有的序列会被过量扩增。这样，在比对的时候，这些过量扩增出来的完全相同的序列就会比对到基因组的相同位置。而这些过量扩增的reads并不是基因组自身固有序列，不能作为变异检测的证据，因此，要尽量去除这些由PCR扩增所形成的duplicates，这一步可以使用picard-tools来完成。去重复的过程是给这些序列设置一个flag以标志它们，方便GATK的识别。还可以设置 REMOVE_DUPLICATES=true 来丢弃duplicated序列。对于是否选择标记或者删除，对结果应该没有什么影响，GATK官方流程里面给出的例子是仅做标记不删除。这里定义的重复序列是这样的：如果两条reads具有相同的长度而且比对到了基因组的同一位置，那么就认为这样的reads是由PCR扩增而来，就会被GATK标记。

java -jar picard-tools-1.96/MarkDuplicates.jar

REMOVE_DUPLICATES= false

MAX_FILE_HANDLES_FOR_READ_ENDS_MAP=8000

INPUT=hg19.reorder.sort.addhead_03.bam

OUTPUT=hg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.bam METRICS_FILE=hg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.metrics

注意： dedup这一步只要在library层面上进行就可以了，例如一个sample如果建了多个库的话，对每个库进行dedup即可，不需要把所有库合成一个sample再进行dedup操作。其实并不能准确的定义被mask的reads到底是不是duplicates，重复序列的程度与测序深度和文库类型都有关系。最主要目的就是尽量减小文库构建时引入文库的PCR bias。

8. 要对上一步得到的结果生成索引文件

可以用samtools完成，生成的索引后缀是bai。

samtools index hg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.bam

9.Local realignment around indels

这一步的目的就是将比对到indel附近的reads进行局部重新比对，将比对的错误率降到最低。一般来说，绝大部分需要进行重新比对的基因组区域，都是因为插入/缺失的存在，因为在indel附近的比对会出现大量的碱基错配，这些碱基的错配很容易被误认为SNP。还有，在比对过程中，比对算法对于每一条read的处理都是独立的，不可能同时把多条reads与参考基因组比对来排错。因此，即使有一些reads能够正确的比对到indel，但那些恰恰比对到indel开始或者结束位置的read也会有很高的比对错误率，这都是需要重新比对的。Local realignment就是将由indel导致错配的区域进行重新比对，将indel附近的比对错误率降到最低。

主要分为两步：

第一步，通过运行RealignerTargetCreator来确定要进行重新比对的区域。

java -jar GenomeAnalysisTK.jar

-R hg19.fa

-T RealignerTargetCreator

-I hg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.bam

-o hg19.dedup.realn_06.intervals

-known Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf

-known 1000G_phase1.indels.hg19.vcf

参数说明：

-R： 参考基因组；

-T： 选择的GATK工具；

-I： 输入上一步所得bam文件；

-o： 输出的需要重新比对的基因组区域结果；

-maxInterval： 允许进行重新比对的基因组区域的最大值，不能太大，太大耗费会很长时间，默认值500；

-known： 已知的可靠的indel位点，指定已知的可靠的indel位点，重比对将主要围绕这些位点进行，对于人类基因组数据而言，可以直接指定GATK resource bundle里面的indel文件（必须是vcf文件）。

对于known sites的选择很重要，GATK中每一个用到known sites的工具对于known sites的使用都是不一样的，但是所有的都有一个共同目的，那就是分辨真实的变异位点和不可信的变异位点。如果不提供这些known sites的话，这些统计工具就会产生偏差，最后会严重影响结果的可信度。在这些需要知道known sites的工具里面，只有UnifiedGenotyper和HaplotypeCaller对known sites没有太严格的要求。

如果你所研究的对象是人类基因组的话，那就简单多了，因为GATK网站上对如何使用人类基因组的known sites做出了详细的说明，具体的选择方法如下表，这些文件都可以在GATK resource bundle中下载。

但是如果你要研究的不是人类基因组的话，那就有点麻烦了，http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/article?id=1243，这个网站上是做非人类基因组时，大家分享的经验，可以参考一下。这个known sites如果实在没有的话，也是可以自己构建的：首先，先使用没有经过矫正的数据进行一轮SNP calling；然后，挑选最可信的SNP位点进行BQSR分析；最后，在使用这些经过BQSR的数据进行一次真正的SNP calling。这几步可能要重复好多次才能得到可靠的结果。

第二步，通过运行IndelRealigner在这些区域内进行重新比对。

java -jar GenomeAnalysisTK.jar

-R hg19.fa

-T IndelRealigner

-targetIntervals hg19.dedup.realn_06.intervals

-I hg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.bam

-o hg19.dedup.realn_07.bam

-known Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf

-known 1000G_phase1.indels.hg19.vcf

运行结束后，生成的hg19.dedup.realn_07.bam即为最后重比对后的文件。

1. 第一步和第二步中使用的输入文件（bam文件）、参考基因组和已知indel文件必须是相同的文件。

2. 当在相同的基因组区域发现多个indel存在时，这个工具会从其中选择一个最有可能存在比对错误的indel进行重新比对，剩余的其他indel不予考虑。

3. 对于454下机数据，本工具不支持。此外，这一步还会忽略bwa比对中质量值为0的read以及在CIGAR信息中存在连续indel的reads。

10.Base quality score recalibration

这一步是对bam文件里reads的碱基质量值进行重新校正，使最后输出的bam文件中reads中碱基的质量值能够更加接近真实的与参考基因组之间错配的概率。这一步适用于多种数据类型，包括illunima、solid、454、CG等数据格式。在GATK2.0以上版本中还可以对indel的质量值进行校正，这一步对indel calling非常有帮助

举例说明，在reads碱基质量值被校正之前，我们要保留质量值在Q25以上的碱基，但是实际上质量值在Q25的这些碱基的错误率在1%，也就是说质量值只有Q20，这样就会对后续的变异检测的可信度造成影响。还有，在边合成边测序的测序过程中，在reads末端碱基的错误率往往要比起始部位更高。另外，AC的质量值往往要低于TG。BQSR的就是要对这些质量值进行校正。

BQSR主要有三步：

第一步：利用工具BaseRecalibrator，根据一些known sites，生成一个校正质量值所需要的数据文件，GATK网站以“.grp”为后缀命名。

java -jar GenomeAnalysisTK.jar

-T BaseRecalibrator

-R hg19.fa

-I ChrALL.100.sam.dedup.realn.07.bam

-knownSites dbsnp_137.hg19.vcf

-knownSites Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf

-knownSites 1000G_phase1.indels.hg19.vcf

-o ChrALL.100.sam.recal.08-1.grp

第二步：利用第一步生成的ChrALL.100.sam.recal.08-1.grp来生成校正后的数据文件，也是以“.grp”命名，这一步主要是为了与校正之前的数据进行比较，最后生成碱基质量值校正前后的比较图，如果不想生成最后BQSR比较图，这一步可以省略。

java -jar GenomeAnalysisTK.jar

-T BaseRecalibrator

-R hg19.fa

-I ChrALL.100.sam.dedup.realn.07.bam

-BQSR ChrALL.100.sam.recal.08-1.grp

-o GATK/hg19.recal.08-2.grp

-knownSites dbsnp_137.hg19.vcf

-knownSites Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf

-knownSites 1000G_phase1.indels.hg19.vcf

第三步：利用工具PrintReads将经过质量值校正的数据输出到新的bam文件中，用于后续的变异检测。

java -jar GenomeAnalysisTK.jar

-T PrintReads

-R hg19.fa

-I ChrALL.100.sam.dedup.realn.07.bam

-BQSR ChrALL.100.sam.recal.08-1.grp

-o ChrALL.100.sam.recal.08-3.grp.bam

主要参数说明：

-bqsrBAQGOP：BQSR BAQ gap open 罚值，默认值是40，如果是对全基因组数据进行BQSR分析，设置为30会更好。

-lqt： 在计算过程中，该算法所能考虑的reads两端的最小质量值。如果质量值小于该值，计算过程中将不予考虑，默认值是2。

（1）当bam文件中的reads数量过少时，BQSR可能不会正常工作，GATK网站建议base数量要大于100M才能得到比较好的结果。

（2）除非你所研究的样本所得到的reads数实在太少，或者比对结果中的mismatch基本上都是实际存在的变异，否则必须要进行BQSR这一步。对于人类基因组，即使有了dbSNP和千人基因组的数据，还有很多mismatch是错误的。因此，这一步能做一定要做。

11. 分析和评估BQSR结果

这一步会生成评估前后碱基质量值的比较结果，可以选择使用图片和表格的形式展示。

java -jar GenomeAnalysisTK.jar

-T AnalyzeCovariates

-R hg19.fa

-before ChrALL.100.sam.recal.08-1.grp

-after ChrALL.100.sam.recal.08-2.grp

-csv ChrALL.100.sam.recal.grp.09.csv

-plots ChrALL.100.sam.recal.grp.09.pdf

参数解释：

-before： 基于原始比对结果生成的第一次校对表格。

-after： 基于第一次校对表格生成的第二次校对表格。

-plots： 评估BQSR结果的报告文件。

-csv： 生成报告中图标所需要的所有数据。

12.Reduce bam file

这一步是使用ReduceReads这个工具将bam文件进行压缩，生成新的bam文件，新的bam文件仍然保持bam文件的格式和所有进行变异检测所需要的信息。这样不仅能够节省存储空间，也方便后续变异检测过程中对数据的处理。

java -jar GenomeAnalysisTK.jar

-T ReduceReads

-R hg19.fa

-I ChrALL.100.sam.recal.08-3.grp.bam

-o ChrALL.100.sam.recal.08-3.grp.reduce.bam

到此为止，GATK流程中的第一大步骤就结束了，完成了variants calling所需要的所有准备工作，生成了用于下一步变异检测的bam文件。

原文来自：http://blog.sina.com.cn/s/blog_12d5e3d3c0101qu6k.html

10：BQSR的第一步 ：出现下面信息怎么解决呢

##### ERROR ——————————————————————————————
##### ERROR A USER ERROR has occurred (version 1.5-32-g2761da9):
##### ERROR The invalid arguments or inputs must be corrected before the GATK can proceed
##### ERROR Please do not post this error to the GATK forum
##### ERROR
##### ERROR See the documentation (rerun with -h) for this tool to view allowable command-line arguments.
##### ERROR Visit our wiki for extensive documentation http://www.broadinstitute.org/gsa/wiki
##### ERROR Visit our forum to view answers to commonly asked questions http://getsatisfaction.com/gsa
##### ERROR
##### ERROR MESSAGE: Could not find walker with name: BaseRecalibrator
##### ERROR ——————————————————————————————