可变剪切(AS)是一种有效和普遍的转录调控机制，扩大了基因组的编码能力，并与癌症的发生和发展相关。目前对结直肠癌(CRC)的可变剪接进行系统的分析非常少，因此研究这个是非常有必要的。

从TCGA数据库下载RNA-seq数据和相应的临床信息。然后，使用SpliceSeq来评估RNA剪接模式，并计算了 Percent Spliced In (PSI)值。根据PSI值比较CRC和癌旁的差异可变剪切事件（DEAS）。利用生物信息学方法进一步分析了DEAS及其剪接网络。最后，采用Kaplan-Meier、Cox比例回归和非监督聚类分析方法，评价DEAS与患者临床特征的关系。

本研究共识别出34,334个AS，其中421个DEAS。这些DEAS的亲本基因在调节蛋白激酶活性、PI3K-AKT信号通路和p53信号通路等CRC相关过程中发挥重要作用。有37个DEAS事件与OS有关，68个DEAS事件与DFS相关，其中AT（CXCL12）和RI（CSTF3）与OS和DFS均显著相关。基于DEAS的无监督聚类分析，显示具有不同生存模式的4个类，并与一致的分子亚型相关。

在CRC中，AS事件似乎存在很大的差异，这些差异可能是预后和生物学调控的重要决定因素。我们所鉴定的DEAS和剪接网络对于揭示CRC中AS的潜在机制具有重要价值，并为进一步验证治疗靶点提供了线索。

接下来，让我们来看看作者具体是怎么做的吧~

一、可变剪切事件鉴定

从TCGA中获得627例CRC患者的RNA-seq数据，经SpliceSeq分析，得到82,411 AS事件（13,201个基因）。根据剪接模式，这些事件大致可分为七种类型，包括外显子跳跃(ES)、互斥外显子(ME)、保留内含子(RI、候补启动子(AP)、候补终止子(AT)、替代供体位点(AD)和候补受体位点(AA)（图a）。将AS事件进行两步过滤：a)具有PSI值的样本大于75%；b)PSI均值大于0.05。经过滤后，剩余34,334 AS事件（8942个基因）。平均一个基因，有4个AS类型。

二、可变剪切事件差异分析

用T检验比较了肿瘤样本和正常人样本的AS事件的PSI值，取|log2FC|>1且adj.P

基于DEAS的无监督的聚类分析，肿瘤样本和正常人样本被清楚地分为两组（图b），这表明以上鉴定的DEAS结果是可信的。DEAS可能直接影响其亲本RNA的表达，特别是当AT或AP事件发生时。为了探讨DEAS与差异表达基因(DEG)之间的关系，我们对DEG中发生的DEAS进行了分析（图c）。如我们所料，影响亲本RNA表达的DEAS，AT(44.4%)和AP(50.0%)占比94.4%。图d是几个基因的AS事件示意图~

三、差异可变剪切富集及互作分析

已经有证据表明AS可以通过一些机制直接影响蛋白质功能。因此，对发生DEAS的亲本基因进行了GO、KEGG富集分析。GO富集分析显示，这些基因多与蛋白结合、细胞形态发生、GTPase调节活性和蛋白激酶活性有关。KEGG富集分析显示，这些基因多富集在PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、NF-kb信号通路等癌症相关通路中。上述结果表明DEAS的亲本基因在调节CRC相关生物学过程中起着重要作用。而这些基因转录体结构的变化必然会影响其蛋白翻译，并进一步修饰其蛋白质特征。因此，有必要从蛋白质网络的角度对这些事件进行研究。基于DEAS相关基因的PPI网络分析不仅显示了正常状态下的交互关系，而且揭示了AS事件对整个网络的潜在影响。

六、与预后和分子亚型相关的AS簇

我们的研究结果表明，每种DEAS在个体水平上的表达差异很大，部分反映了CRC患者的预后。因此我们思考通过对所有样本进行无监督的聚类，是否可以根据421的DEAS来识别出不同的AS模式。通过结合用肘子法（Elbow method）和Gap statistic，我们确定了分类数k=4（图a，b）。临床数据和突变数据与聚类结果一起展示在图c，我们发现不同的CMS、TNM分期、KRASm和生存状态(OS和DFS) 的CRC样本在集群间中的分布不是随机的。例如，归类为C3的肿瘤样本有更频繁的KRAS突变和富集的CMS4和晚期TNM分期。作为CRC的先前定义的共识分子亚型，CMS4已被证明包括更多的间充质样癌症，具有高的基质浸润和较差的患者预后。因此，我们进行了Kaplan-Meier分析，以评估聚类和预后之间的关系。结果表明，聚类与不同的预后显著相关，其中C3的肿瘤样本在OS和DFS分析中均与不良预后相关（图d）。总的来说，这些发现表明，CRC的AS有相当大的差异，部分是由原发性肿瘤的分子特征决定，进而影响了临床结果。

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