CRISPR基因组编辑是目前大热的新技术，它利用短RNA（gRNA）来引导核酸酶（Cas9）到达DNA靶点。与之前的基因组编辑方法（ZFN和TALEN）相比，这种新方法具有快速、高效、廉价且易于操作等优点，因而被快速采用。眼看着CRISPR频频出现在各大期刊上，也许你也想尝试一下这种新技术。在此，我们就介绍一下CRISPR实验的一些主要步骤，以及需要考虑的因素。

1. 选择一个CRISPR系统

首先，你要考虑一下为什么要使用CRISPR系统，是破坏感兴趣的基因，还是编辑或修饰内源的基因组？这需要通过不同的修复途径来实现。

破坏感兴趣的基因

Cas9核酸酶有两个功能结构域：RuvC和HNH，每个切割一条不同的DNA链。当这两个结构域激活时，Cas9在基因组DNA上产生双链断链（DSB）。在缺乏适当的修复模板时，DSB通过非同源末端连接（NHEJ）途径来修复。在NHEJ修复过程中，DSB位点会随机插入或删除几个核苷酸，这可能带来插入缺失（InDel）。InDel改变目的基因的开放阅读框（ORF），可能明显改变DSB下游的氨基酸序列。此外，InDel可能引入提前终止密码子。这种修复的结果就是目的基因被破坏。不过需要注意的是，NHEJ引入的InDel是随机的，因此需要通过实验来确定基因破坏的类型和程度。

编辑/修饰内源基因组

CRISPR系统也能在目标序列上引入特定的核苷酸修饰，这就要依靠另一种修复机制：同源指导修复（HDR）。在HDR修复过程中，必须存在一条包含所需序列的DNA修复模板。DNA模板通常与gRNA/Cas9一起转染到细胞中，并且必须与DSB上下游的序列有着很高的同源性。当合适的模板存在时，HDR能在Cas9诱导的DSB上引入特定的核苷酸修饰。同样，这个修饰也必须通过实验来证实。

目前有多个厂家提供CRISPR质粒，包括Life Technologies、Sigma-Aldrich等。他们大多提供all-in-one的系统，既表达Cas9核酸酶，又表达gRNA，这样很方便。具体可看我们之前的系列文章：CRISPR新品巡礼。

此外，许多科学家也对CRISPR/Cas系统的一些元件进行了改造，以增强系统的特异性或实现某些特定的功能。如果你需要这样的一些质粒，可以去Addgene网站上查找（ www.addgene.org ）。同时，它也收录了一些知名的实验室设计的质粒。Addgene是一个非营利性组织，主要是为了减少研究人员索取质粒的繁琐过程，但它会收取一定的手续费和运费。

Addgene目前在中国的经销商是北京中原公司。这也就是说，你在网站上找到了感兴趣的质粒，可以通过电话（400-8100-881/86-10-84415678）或电子邮箱 ( [email protected] ) 的方式向北京中原公司下订单。

2. 设计你的gRNA

一旦你决定了使用哪种系统，下一步就是设计你的gRNA啦。在基因组DNA中选择适当的目标序列，这对实验设计来说是非常重要的一步。

基因组靶点的重要特征包括：

• 长度大约在20个核苷酸。
• 后面（或前面）是PAM序列。注意：PAM随着Cas9来源的细菌种类的不同而变化。Cas9和gRNA必须来自同一种细菌。

对于设计的gRNA，它：

• 不包含PAM序列。
• 可以是基因组DNA的任一条链。
- 对于基因组破坏，gRNA靶定的位点应靠近蛋白编码区的N端，以便增加基因破坏的可能性。
- 对于基因组编辑或修饰，gRNA靶定位点将限于编辑或修饰的位置。
• 应利用生物信息学软件来设计，以尽量避免脱靶效应。

以下总结了一些设计gRNA的软件。同时，Addgene也提供一些经过验证的gRNA。

张锋实验室的Target Finder： http://crispr.mit.edu/
Michael Boutros实验室的E-CRISP： http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html
CasFinder： http://arep.med.harvard.edu/CasFinder
CRISPR Optimal Target Finder： http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/

Broad研究院的CRISPR专家John Doench曾经分享了一些设计gRNA的经验，请看： CRISPR实验中如何设计gRNA 。

3. 将gRNA克隆到质粒中

这一步不必多说，就是普通的克隆，大家都是专家。克隆之后，通过测序来验证最终的质粒产物。

4. 导入CRISPR元件

如果你使用的是哺乳动物细胞，那么自然可以使用一些常用的DNA导入方法，比如转染、电穿孔和病毒导入。对于普通的细胞系（如HeLa、HEK 293），转染并非难题，哪种方法都行。对于ES细胞和iPS细胞，电穿孔的方法效果会更好。对于原代细胞，病毒导入可能更理想。如果你用的是其他的模式生物，比如线虫、斑马鱼，那么可以参考Addgene上的实验方案（ http://www.addgene.org/CRISPR/reference/#protocols ）。

5. 评估效果

一些公司已经推出了试剂盒来评估基因组编辑的效率，比如Life Tech的GeneArt® Genomic Cleavage Detection Assay，采用错配检测内切酶来检测细胞内NHEJ修复期间因插入和/或删除而产生的插入或缺失。Clontech也推出了Guide-it Mutation Detection Kit。当然，你还可以通过测序对序列进行验证。CRISPR与新一代测序相遇，会擦出怎样的火花？欢迎阅读： 在CRISPR/Cas9相关研究中应用新一代测序技术 。（生物通 薄荷）

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