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图一：MLKL靶点蛋白结构。图片来源：SWISS-MODEL。
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MLKL靶点介绍
MLKL在TNF诱导的程序性细胞坏死过程中起关键作用。
MLKL属于蛋白激酶超家族，包含一个蛋白激酶样结构域，但是蛋白激酶结构域无催化活性。是拥有激酶结构域，但是没有激酶功能的假激酶。
MLKL在被RIPK3磷酸化后激活，定位于质膜并执行以钙流入和质膜损伤为特征的坏死性凋亡。
除了 TNF 诱导的坏死性凋亡外，细胞核内也可能发生坏死性凋亡。在被 ZBP1 激活后，MLKL 被细胞核中的 RIPK3 磷酸化，导致核被膜破坏和细胞 DNA 泄漏到细胞质中。
MLKL与 RIPK3 的相互作用是有物种特异性的：人类 MLKL 仅与人类 RIPK3 相互作用，而不与小鼠 RIPK3 相互作用。
磷酸化修饰的MLKL（p-MLKL）是坏死性凋亡的触发因素。它不存在于正常组织中，只能在感染、细胞受损或老化组织中检测到。
MLKL激活后会形成同源三聚体。
p-MLKL需要坏死性凋亡诱导刺激（常用TSZ-TNF a+Smac mimetic+z-VAD）之后，才能检测得到。
MLKL定位于细胞质，在发生坏死性凋亡时异位至质膜。当响应正粘病毒感染时定位于细胞核。
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图二：MLKL ICC实验结果图，Recombinant Alexa Fluor
®
488 Anti-MLKL antibody [EPR17514] (
ab207901
)。绿色：MLKL，红色：Tubulin。
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人（Q8NB16）：异构体 1-2；30~54 kDa（预测）
小鼠（Q9D2Y4）：异构体 1-2；53~54 kDa（预测）
磷酸化修饰。
可以被针对细胞程序性坏死的抑制剂necrosulfonamide（NSA）抑制功能。
MLKL的激活不仅需要被RIPK3 磷酸化，并且需要结合高度磷酸化的磷酸肌醇。
WB
实验贴士
样本需要坏死性凋亡的诱导刺激，如TSZ（TNF a+Smac mimetic+z-VAD）处理之后，才能检测到p-MLKL。
建议检测MLKL信号通路中上下游指标，确认诱导是否成功。
进行磷酸化修饰检测时，请先确认细胞内MLKL总蛋白的含量。
使用新鲜制备的样本，防止冻存样本导致磷酸化修饰减弱，并添加合适的磷酸酶抑制剂。
推荐根据蛋白修饰不同，使用合适的阳性对照。
如果使用常规裂解方法，检测到蛋白信号较弱时，我们建议尝试使用 1% SDS 热裂解方法来制备细胞裂解物。
MLKL：Huvec、HeLa细胞裂解液。
p-MLKL：用 TNF α+Smac mimetic+z-VAD 处理8小时的 HT-29 细胞裂解液。
人MLKL敲除HeLa细胞系(
ab255408
)/细胞裂解物(
ab263788
)。
结果示例
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图三：
WB-
重组
Anti-MLKL
抗体
[EPR17514] (
ab184718
)
。
泳道
1
：
HUVEC细胞裂解液。
泳道
2
：
HT-29细胞裂解液。
泳道
3
：
野生型HeLa细胞裂解液。
泳道
4
：
MLKL敲除的HeLa细胞裂解。
结果描述：
MLKL（绿色），GAPDH（红色）。
预测条大小：
54 kDa。
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图四：
WB-
重组
Anti-MLKL (phospho S345)
抗体
[EPR9515(2)] (
ab196436
)
泳道
1
：
未处理的 L-929（小鼠结缔组织成纤维细胞）全细胞裂解液。
泳道
2
：
L-929用 20 ng/ml TNF α (
ab9642
)、100 nM Smac mimetic和 20 µM z-VAD (
ab120382
) 处理 8 小时，然后获得的全细胞裂解液
。
检测条带大小：
54 kDa
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参考文献
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Liming Sun, Huayi Wang, Zhigao Wang, Sudan He, She Chen, Daohong Liao, Lai Wang, Jiacong Yan, Weilong Liu, Xiaoguang Lei, Xiaodong Wang. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 2012 Jan 20;148(1-2):213-27. doi: 10.1016/j.cell.2011.11.031.
-
Zhigao Wang, Hui Jiang, She Chen, Fenghe Du, Xiaodong Wang. The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways. Cell. 2012 Jan 20;148(1-2):228-43. doi: 10.1016/j.cell.2011.11.030.
-
Zhenyu Cai, Siriporn Jitkaew, Jie Zhao, Hsueh-Cheng Chiang, Swati Choksi, Jie Liu, Yvona Ward, Ling-Gang Wu, Zheng-Gang Liu. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol. 2014 Jan;16(1):55-65. doi: 10.1038/ncb2883. Epub 2013 Dec 8.
-
Lorenzo Galluzzi, Oliver Kepp, Francis Ka-Ming Chan, Guido Kroemer. Necroptosis: Mechanisms and Relevance to Disease. Annu Rev Pathol. 2017 Jan 24;12:103-130. doi: 10.1146/annurev-pathol-052016-100247. Epub 2016 Dec 5.
-
Junying Yuan, Palak Amin, Dimitry Ofengeim. Necroptosis and RIPK1-mediated neuroinflammation in CNS diseases. Nat Rev Neurosci. 2019 Jan;20(1):19-33. doi: 10.1038/s41583-018-0093-1.
PMID: 22265413, 22265414, 24316671, 27959630, 30467385
