细胞培养FAQ

1. 何为细胞传代？

细胞生长至单层汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生长空间不足或由于细胞密度过大引起营养不够，而影响细胞的生长，这一过程称为传代或 传代培养 。通俗地说是将一瓶细胞一分为二或者一分为三或更多进行扩增培养。

2. 细胞如何传代？

细胞长到对数生长期，通常说的80-90%汇合就需传代。通常用0.25% Trypsin-0.53mM EDTA消化液解离细胞。先吸净培养瓶里的培养液，加3-5mlPBS洗一次，接着加1ml消化液（ 25cm ² ) 于无细胞面，放于37℃温箱预热1-3min，之后翻转培养瓶让消化液接触细胞30S-1min，显微镜下观察细胞，大部分细胞变圆，即可加5ml左右完全培养基终止胰酶作用，轻轻打匀细胞后，按10ml/瓶补加培养液后分瓶传代培养。

3. 细胞如何冻存？

对数生长期细胞用0.25% Trypsin-0.53mM解离细胞后，1000rpm/min离心5分钟收集细胞，加入冻存液（完全培养基+10%DMSO,现用现配），细胞冻存数一般是 1-2x10 ⁶ ，按1ml/支分装冻存管放入冻存盒，按慢冻存原则先-80℃过夜后移入液氮罐长期保存。无冻存盒按4℃-30min → -20 ℃ -30min→-80 ℃ - 过夜 → 液氮的过程操作。

4 . 冷冻管应如何解冻？

取出冷冻管后，立即放入 37 °C 水浴中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在 2 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮罐中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管爆裂，最好戴防护面罩。

5 . 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO ？

除少数特别注明对 DMSO 敏感细胞外， 绝大部分细胞株， 在解冻之后， 直接移入含有 10ml 新鲜培养基的培养瓶（ 25 cm ² ）中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可。

6 . 可否使用与原先培养不同的培养基？

不建议。每一细胞株均有其特定使用且已适应的培养基， 若突然更换培养液， 细胞可能无法立即适应， 造成细胞生长状态不好，甚至无法存活。实在要换，可采取半量换，逐渐过渡的方法。

7 . 可否使用与原先培养条件不同的血清种类？

不建议。血清是细胞生长的一个极为重要的营养来源，血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。不同批次和不同等级的血清，所含成分在量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法传代。

8 . 何谓 FBS, FCS, NCS,CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calfserum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清； FCS 是错误的用法， 不再使用； CS (calf serum) 则是指小牛血清； HS (horseserum) 则是指马血清。

9 . 培养细胞时使用 5 % 或 10% CO ₂ ？

一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为 pH 的缓冲系统， 而培 养基中 NaHCO₃ 的 含量将决定细胞培养时应使用的 CO ₂ 浓度。当培养基中 NaHCO₃ 含量为每公升 3.7 g 时，细胞培养时应使用 10 % CO ₂ ；当培养基中 NaHCO₃ 为每公升 1.5 g 时， 则应使用 5 % CO ₂ 培养细胞。

10 . 何时须更换培养基？

视细胞生长密度和 PH 变化来定。显微镜下观察细胞，最好在 4X 或 5X 物镜下，若细胞生长未达到 80-90% 汇合时；或培养液 PH 过酸或过碱时，可更换培养基。

11 . 培养基中是否须添加抗生素？

除了特殊筛选系统需要添加抗生素， 正常培养情况下， 不建议培养基中添加抗生素。

12 . 贴壁细胞传代时所使用的 trypsin-EDTA 浓度？

一般使用 trypsin-EDTA 浓度为 0.25% trypsin-0.53mMEDTA 。需小量分装于无菌试管中， 保存于 –20°C ，避免反复冷冻解冻造成 trypsin 的活性降低， 而且可减少污染的机会。

13 . 悬浮细胞应如何传代？

一般仅需加入新鲜培养基于原培养瓶中即可。若显微镜下观察细胞密度太大而液又太多时，可分瓶传代，补加培养液后吸出一半至另一新的培养瓶中即可。

14 . 细胞离心时的离心速率应为多少转速？

离心收集细胞时离心速率一般为 300xg ( 约 1,000rpm) ， 5 - 10 分钟， 过高转速， 会造成细胞生长状态不好。

15 . 使用什么级别的 DMSO ？需要除菌吗？

冷冻保存使用的 DMSO 等级， 必须为 Tissue culturegrade ， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后最好少量分装于无菌管中， 保存于 4°C ， 避免反复冷冻解冻造成 DMSO 之裂解而释放出有害物质。若要过滤 DMSO ， 则须使用耐有机溶剂的 Nylon 材质滤膜过滤。

16 . 应如何避免细胞污染？

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体等。主要的污染原因为无菌操作不当、操作室环境不佳、污染的各种液体和污染的细胞等。严格的无菌操作技术、清洁的环境、正规的细胞来源和培养基配制是减低污染的最好方法。

17 . 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？

最好直接灭菌后丢弃。除非细胞比较珍贵，才作除菌处理。

18 . 支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否肉眼能观察出来？

不能。除极有经验的专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨。

19 . 支原体污染会对细胞生长有何影响？

支原体可影响所有细胞的生长参数，故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free ，实验结果的数据方有意义。

20 . 检测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？

直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。

21 . CO ₂ 培养箱的水盘如何保持清洁？

定期更换水盘里的水，至少每两周更换一次，用无菌蒸馏水或无菌去离子水。

22 . 为何培养基保存于 4 °C 冰箱中， 颜色会偏红， pH 值越来越偏碱性？

培养基保存于 4 °C 冰箱中， 培养基内的 CO ₂ 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中的酸碱指示剂 ( 通常为 phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏红。培养基偏碱的结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤的 CO2 或用 1N 的盐酸调整 pH 值。

23 . 不同厂牌的细胞培养器皿是否均相同？

不同厂家的培养器皿， 其所 coating 的 polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有太大的影响， 但少数细胞则可能因使用厂家不同的培养瓶或培养皿会有一些生长差异。

24 . 购买的细胞死亡或存活率太低可能的原因？

细胞培养时出现存活率不佳或死亡， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；解冻过程错误；悬浮细胞误认为死细胞；培养温度使用错误；细胞置于 –80 °C 太久。

25 . 冻存管爆裂的原因？

冻存管爆裂是冻存细胞时冷冻管盖未拧紧导致液氮或水进入到冻存管内或是冻存管质量不好，复苏细胞时因温度差异太大而致，故冻存管于放入和取出液氮罐时，均应立刻将冷冻管盖再一次扭紧，选用质量好的冻存管。