液-液相分离（Liquid-liquid phase separation, LLPS）是细胞内很多重要生命过程的关键驱动机制。在真核细胞中，LLPS能让各种相关的生物分子富集，帮助细胞形成各种无膜结构，如P颗粒（P-granules），核仁（nucleoli），异染色质（heterochromatin）和应激颗粒（stress-granules）等，从而实现提高生化反应效率，或是在压力环境下保护mRNA和蛋白质等重要细胞成分。LLPS具有可逆性并对环境因素高度敏感，近些年被证明是细胞响应外界压力及快速动态划分细胞空间结构的重要机制。与真核细胞相比，原核细胞内部更为拥挤并缺少有膜细胞器。液-液相分离机制在原核细胞中发挥了怎样的作用还存在较多未知。
北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、北京未来基因诊断高精尖创新中心（ICG）、生命科学学院
白凡
课题组曾于2018年在
Molecular Cell
杂志上发表题为
ATP-dependent dynamic protein aggregation regulates bacterial dormancy depth critical for antibiotic tolerance
的研究论文，报道了细菌中存在的一种可动态聚集和分散的新型细胞内结构—蛋白质沉淀聚集体（aggresomes）。Aggresomes在显微镜明场下呈现为分布在细菌胞内的小黑点，在细胞遭遇外界压力（营养缺乏、抗生素攻击）时形成，促进细胞进入休眠状态；在外界环境改善后，aggresomes被清除，细菌重新恢复生长。围绕细菌aggresomes形成的微观机制，2021年10月20日白凡课题组与英国约克大学的
Mark C. Leake
课题组合作在
Science Advances
杂志上发表题为
Membraneless organelles formed by liquid-liquid phase separation increases bacterial fitness
的研究论文，通过单分子高分辨率荧光显微追踪和多尺度数学建模，证明aggresomes是通过液-液相分离机制形成的无膜细胞器，在细菌对抗逆境和抗生素耐药中发挥了关键作用。
研究团队首先选择了三种在aggresomes中富集的蛋白质（HslU, Kbl, AcnB）作为研究对象，分别为其构建带有荧光标记的融合蛋白。通过在细菌内过表达HokB（一种细菌Toxin），降低细菌细胞内ATP水平，从而人为诱导aggresomes的形成（图1）。实验结果显示，三种蛋白在加入aggresomes的过程中展现出不同的动力学特征，其中HslU最快形成荧光聚集体，随后是Kbl，而AcnB最晚。
接下来，研究者选择了响应速度最快的HslU蛋白作为aggresomes的生物标记，通过单分子荧光追踪来探索aggresomes形成的时空动态特征。运用Slimfield单分子追踪技术（图1C），研究者获得了单个HslU-EGFP分子在aggresomes内部的运动轨迹和平均扩散系数，发现HslU蛋白在aggresomes内部能够自由移动，由此说明aggresome内并非固态；与此同时，在显微镜下观察aggresomes形成的动态过程，发现在aggresomes形成早期，细胞内不同aggresomes之间会发生碰撞—融合过程，两个较小的聚合体能够融合形成一个更大的聚合体（图2C），这也说明aggresomes具有液滴状性质；研究者进一步使用了荧光漂白恢复技术（FRAP）来定量aggresome内部蛋白质分子的流动性。当使用高强度会聚激光淬灭掉aggresome中一半的荧光蛋白后，可以观察到被淬灭区域的荧光信号缓慢回升（图2D，2E），证明aggresomes内部EGFP荧光分子能够进行自由交换。以上多重证据表明，沉淀聚集体内的蛋白质并不是紧密聚合，而是处于可部分自由运动的液体状态。进一步，通过细菌胞内ATP测量，研究团队发现细菌胞内ATP浓度下降而触发的液-液相分离是aggresomes形成的核心机制。
