继类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）和锌指核酸内切酶（ZFN）之后，出现了新一代的基因编辑工具——CRISPR/Cas系统。作为能够进行定点基因编辑的工具，CRISPR/Cas系统迅速成为广大科研工作者的新宠。CRISPR全称是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（成簇的规律间隔的短回文重复序列），Cas的全称是CRISPR-associated protein，大家都简称为CRISPR/Cas系统。Jennifer Doudna等人最初从原核生物中发现一种结构能够抵御外来遗传物质的入侵，张峰最先将这个系统应用于哺乳动物细胞的基因编辑，那么这个CRISPR/Cas的结构是怎样的？又是如何起作用的？要如何使用它实现基因敲除？

CRISPR/Cas的作用过程主要分为两个阶段， 第一阶段，捕获外源引入的序列（对于常用的CRISPR/cas9系统来说，第一阶段是sgRNA和Cas蛋白结合）；第二阶段，转录之后的crRNA会形成pre-crRNA，引导Cas蛋白对基因组上与sgRNA相同的靶向区域进行切割，从而达到基因编辑的目的。

使用CRISPR/cas实现基因敲除，主要有两种策略。 第一种是敲除绝大部分的外显子，将编码靶基因的功能域都敲除。 对于这种敲除方式，一般敲除之后就能保证敲除的效果，不会有蛋白残留问题，但是也有一些缺点，如果靶基因过大，敲除的难度会大大增加，另外敲除的片段会游离在细胞中，可能会以NHEJ的形式随机插入到基因组的其他位置，所以会降低敲除的阳性率。

第二种是敲除个别外显子，造成移码，进而达到敲除的目的。 这种敲除方式，在DNA水平，较容易获得纯合敲除的细胞株，但是这种敲除方式，需要在合适的位置设计sgRNA，否则就会出现在DNA水平虽然造成了移码，ORF改变，但是Western Blot（WB）检测可能仍有表达。

开展敲除实验时，目的基因、细胞类型、下游实验等均会影响方案设计和最终的敲除结果。所以需要根据实际情况来设计方案。 比如需要考虑目的基因是否会影响细胞存活、细胞类型对敲除效率的影响和导入方法对下游实验的影响等。如果敲除与细胞周期、增殖、代谢等相关的基因，会存在敲除致死的情况，难以获得敲除纯合细胞株；对于增殖速度慢的细胞类型，往往难以开展敲除实验，这是由于细胞增殖过慢影响细胞的DNA修复活性并降低了编辑效率。

另外将CRISPR/Cas体系导入细胞的方式也是多种多样的，我们常用的有三种 ，蛋白法、质粒法、病毒法。 一般我们会选用蛋白法来做，直接合成sgRNA单链，和Cas蛋白在体外孵育形成RNP复合物，在通过电转的形式将RNP复合物导入细胞中，这样既在较短时间内获得纯合敲除的单克隆细胞株，又不会在基因组上造成外源基因的整合，省时高效。质粒法和病毒法适合用于细胞倍增较慢的细胞系，相较于蛋白法来说，病毒法会引入外源质粒序列的整合，具体如何选用敲除方式，还要根据下游的实验来综合判断。