非洲爪蟾的碱性螺旋-环-螺旋转录因子的鉴定与初步分析 Genome-Wide Survey, Identification and Preliminary Analysis of Xenopus La

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刘武艺非洲爪蟾的碱性螺旋–环–螺旋转录因子的鉴定与初步分析 |

录调控区、寡聚化位点及核定位信号区等 [1-5] 。有关转

录因子结构和功能的研究是动植物分子生物学研究

的前沿领域，转录因子因其含有 DNA 结合蛋白的不

同可以划分为不同的基因家族 [1-3] 。碱性螺旋–环–螺

旋 (basic helix-loop-helix ， bHLH) 转录因子是目前最大

的转录因子家族之一，并被公认为在细胞增殖与分

化、肌肉形成、神经元、肠和血、性别决定等遗传发

育过程中具有重要作用 [4-8] ，许多课题组对 bHLH 转录

因子展开了研究。最早报道的是鼠转录因子 E12 和

E47 [9] ，后来的研究将动物 bHLH 转录因子划分为 6

大类，这些大类又细分为 45 个亚类或蛋白家族

[4,6,10,11] 。现在，动物的 bHLH 家族成员的分类、进化

及功能分析现已积累大量资料，且基本清楚各家族组

成及成员的功能。由于生物物种基因组测序和全基因

组草图绘制工作的陆续完成，越来越多的转录因子被

分析和鉴定出来，这就为从整体上研究某物种转录因

子的功能和进化等重要问题提供了可能。因此，从全

基因组角度研究某一类型的转录因子或调控因子具

有重要的意义。现今，动物 bHLH 转录因子家族已经

在人、小鼠、大鼠、鸡、蚕、蜜蜂等许多物种的基因

组中被鉴定和研究 [4-17] 。但在非洲爪蟾 ( Xenopus laevis )

基因组中尚未进行有关的研究。

非洲爪蟾是较早用于生物医学的重要模式动物

之一 [19] 。本研究以 Atchley et al. (1999) 的 bHLH 转录

因子分类原则 [10] ， Ledent et al. (2001, 2002) 定义的 45

个 bHLH 代表性基序 (domains) 和 118 个人 bHLH 基因

序列为鉴定标准 [6,11] ，从非洲爪蟾的基因组数据库鉴

定出 98 个 bHLH 转录因子，进行基因本体论 (Gene

Ontology ， GO) 富集分析，以期分析和了解这些 bH LH

基因的功能信息。

2. 材料与方法

2.1. BLAST 搜索和 bHLH 转录因子的鉴定

根据 Atchley et al. (1999) 的 bHLH 转录因子分类

原则和 Ledent et al. (2001, 2002) 定义的 45 个代表性

bHLH 基序 [6,11] 进行 TBLASTN 和 BLASTP ，搜索候选

bHLH 基序。其中，每条序列都被用于对 NCBI 的非

洲爪蟾的基因组数据库 [19] 进行反复搜索 (http://

www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/frog/) ，搜索的严

谨值设为 E < 10 ，以获取所有可能的 bHLH 序列。同

时，我们也检索蛙蟾数据库 Xenbase [20] ，最后根据

scaffold 或基因克隆 (genomic clone) 的编号、编码区、

基因和蛋白获取号、序列比对的结果等信息，去除冗

余序列，得到最终采用的 bHLH 因子序列。

2.2. 序列比对和基序比较

通过 BLAST 搜索得到的爪蟾蛋白质序列，用

ClustalX 2.0 [21] 进行比对，接着用 GeneDoc 2.6 [12] 做保

守序列的分析和比较。

2.3. 基因本体 (Gene ontology ， GO) 注释的富集

分布分析

利用 DAVID 生物信息工具 [22,23] 做 GO 注释的富

集分析，富集分布的显著性 P 值和假阳性率 (False

positive rate ， FDR) 均被控制在 0.05 以下。

2.4. BHLH 同源基因的系统发育分析

系统发育分析 (Phylogenetic analyses) 用最大似然

估计软件 PHYML 2.4.4 [24] 和贝叶斯推断软件 Mrbayes

3.12 [25] 进行系统发育树推断。其中，贝叶斯推断采用

两个独立的马科夫链进行推断 ( 进行 14,000,000 步马

科夫链抽样，抽样频率为每代抽样 100 个 ) ，取 50%

一致树作为最终的系统发育树。

3. 结果与讨论

3.1. 爪蟾 bHLH 转录因子的鉴定

利用上述 bHLH 代表性基序、 TBLASTN 和

BLASTP 算法及系统发育分析，搜索鉴定得到了 98

条爪蟾的 bHLH 序列 ( 图 1 、表 1) 。图 1 所示的 bHLH

转录因子名称通过与人的同源序列 (homolog) 的系统

发育树分析得到。若一条人的 bHLH 因子拥有两个以

上爪蟾同源序列，我们将之分别标注为 a 、 b 、 c ，或 1 、

2 、 3 等名称。例如，人的 Hath5 和 Hath4a 在爪蟾基

因组中发现有两个同源序列，那么爪蟾的相应同源序

列就会被命名为 Xath5a 、 Xath5b ，和 Xath4a1 、 Xath4a2 。

本研究发现，爪蟾的 98 个 bHLH 转录因子分别有 39 、

22 、 13 、 5 、 16 和 3 个因子可以被归类到 6 个高阶组

(high-order group)A-F 的 32 个小家族；而某些小家族，

如 Mist 、 Beta3 、 Oligo 、 Net 、 Delilah 、 MyoRb 、 PTFa 、

TFb 、 AP4 、 MLX 和 TF4 等家族的成员没有 P

刘武艺非洲爪蟾的碱性螺旋–环–螺旋转录因子的鉴定与初步分析 |

Table 1. 98 bHLH genes in phylogenetic analysis and protein identification information

表 1. 98 个 bHLH 基因的系统发育分析和蛋白质鉴定信息

各因子与人同源序列的系统发育分析信息

bHLH

基因家族

基因

名称同源基因 ML 自展值 (%) BI 后验概率 (%)

蛋白质获取号

ASCa Xash 1 Hash 1 n/m* 80 NP_001079247.1

ASCa Xash 2 Hash 2 96 67 NP_001085994.1

ASCb Xash 3 a

Hash 3 a

Hash 3 b

Hash 3 c

n/m n/m NP_001079106.1

ASCb Xash 3 b

Hash 3 a

Hash 3 b

Hash 3 c

n/m n/m NP_001079125.1

MyoD Myf 3 a Myf 3 93 83 NP_001079366.1

MyoD Myf 3 b Myf 3 93 83 NP_001081292.1

MyoD Myf 4 a Myf 4 82 99 NP_001079326.1

MyoD Myf 4 b Myf 4 88 99 NP_001079199.1

MyoD Myf 5 Myf 5 51 59 NP_001095249.1

MyoD Myf 6 a Myf 6 n/m* 94 NP_001081477.1

MyoD Myf 6 b Myf 6 n/m* 94 NP_001088572.1

E12/E47 E 2 A E 2 A 82 n/m NP_001080409.1

E12/E47 TCF 3 TCF 3 n/m* 88 NP_001079668.1

Ngn Xath 4 a 1 Hath 4 a 97 100 NP_001081802.1

Ngn Xath 4 a 2 Hath 4 a 97 100 NP_001081804.1

Ngn Xath 4 b Hath 4 b 83 91 NP_001128257.1

NeuroD NDF 1 NDF 1 82 97 NP_001079263.1

NeuroD NDF 2 NDF 2 82 97 NP_001085596.1

Atonal Xath 2 Hath 2 n/m* 79 NP_001079218.1

Atonal Xath 3 Hath 3 97 99 NP_001081213.1

Atonal Xath 5 a Hath 5 95 100 NP_001079289.1

Atonal Xath 5 b Hath 5 95 100 NP_001079290.1

Mesp Mesp 1 a

Mesp 1

Mesp 2

pMesp 1 n/m n/m NP_001128698.1

Mesp Mesp 1 b

Mesp 1

Mesp 2

pMesp 1 n/m n/m N P_001091431.1

Mesp Mesp 2 a

Mesp 1

Mesp 2

pMesp 1

n/m n/m NP_001079050.1

Mesp Mesp 2 b

Mesp 1

Mesp 2

pMesp 1

n/m n/m NP_001081641.1

Mesp pMeso 1 pMesp 1 99 100 NP_001083813.1

Mesp pMeso 2 pMesp 1 99 100 NP_001136111.1

Twist Twist 1 Twist 1

Twist 2 98 n/m NP_001079352.1

Twist Twist 2 Twist 1

Twist 2 98 n/m NP_001091211.1

Paraxis Paraxis Paraxis 62 77 NP_001087941.1

Paraxis Sclerax Sclerax 80 100 NP_001092152.1

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MyoRa MyoRa MyoRa 1

MyoRa 2 82 100 NP_001085957.1

Hand Hand 1 Hand 1 92 100 NP_001079128.1

Hand Hand 2 a Hand 2 98 100 NP_001079108.1

Hand Hand 2 b Hand 2 98 100 NP_001107665.1

SCL Tal 1 Tal 1 n/m* 56 NP_001081746.1

NSCL NSCL 1 NSCL 1 n/m* 100 NP_001081852.1

NSCL NSCL 2 NSCL 2 89 100 NP_001088421.1

SRC SRC 1 SRC 1 98 100 NP_001154867.1

SRC SRC 2 SRC 2 92 100 NP_001081139.1

SRC SRC 3 SRC 3 78 99 NP_001081732.1

Fig α Fig α Fig α 87 100 NP_001088667.1

MYC l-Myc 1 L-Myc 1 99 100 NP_001081340.1

MYC l-Myc 2 L-Myc 2 54 100 NP_001079460.1

MYC n-Myc 1 n-Myc 71 99 NP_001079365.1

MYC n-Myc 2 n-Myc 71 99 NP_001084122.1

MYC v-Myc v-Myc 88 100 NP_001080349.1

Mad Mxi 1 Mxi 1 n/m 97 NP_001089170.1

Mad Mad 1 Mad1a n/m* 71 NP_001090200.1

Mad Mad 3 Mad 3 99 100 NP_001090188.1

Mad Mad4a Mad 4 84 97 NP_001079167.1

Mad Mad4b Mad 4 84 97 NP_001084456.1

Mnt Mnt Mnt 72 99 NP_001089310.1

MAX MAX 1 MAX 86 100 NP_001079118.1

MAX MAX 2 MAX 86 100 NP_001089042.1

USF USF 1 USF 1 98 100 NP_001089471.1

USF USF 2 USF 2 99 100 NP_001088134.1

USF USF 3 USF 3 99 100 NP_001088700.1

MITF TFE 3 TFE 3 91 88 NP_001088215.1

SREBP SREBP 2 SREBP 2 82 97 NP_001085554.1

Clock Clock Clock 100 100 NP_001083854.1

ARNT ARNT 1 ARNT 1 n/m* 100 NP_001082130.1

ARNT ARNT 2 a ARNT 2 99 100 NP_001080540.1

ARNT ARNT 2 b ARNT 2 99 100 NP_001083622.1

Bmal Baml 1 a Bmal 1 n/m* 59 NP_001089024.1

Bmal Baml 1 b Bmal 1 n/m* 59 NP_001089031.1

AHR AHR 1 AHR 1 91 100 NP_001082693.1

AHR AHR 2 AHR 2 94 100 NP_001121349.1

Sim Sim 2 Sim 2 82 97 NP_001079101.1

HIF Hif1 α 1 Hif 1 α 99 54 NP_001086426.1

HIF Hif1 α 2 Hif 1 α 99 54 NP_001080449.1

HIF EPAS 1 a EPAS 1 87 92 NP_001085564.1

HIF EPAS 1 b EPAS 1 87 92 NP_001085718.1

Emc Id 2 a Id 2 75 69 NP_001087639.1

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注释：所有的GO语句均来自国际基因本体数据库 (http://www.geneontology.org) 。

Figure 2. Forty - two significant GO annotations counts plotted by frequency

图 2. 42 个统计显著的 GO 注释 (GO Aa nnotation) 出现频次的柱状图统计

录共激活是 bHLH 类因子的主要功能活动。但是，除

了这些转录因子共有的功能之外， bHLH 转录因子还

有其自身特殊的功能活性。为了进一步探讨爪蟾

bHLH 转录因子家族的整体功能特点，我们收集了这

98 个 bHLH 因子的基因本体论 (GO) 的功能注释信息。

其中， 42 个超几何分布统计检验显著 ( P < 0.05) 的 GO

注释语句显示在图 2 中，这些 GO 语句表示了一些重

要的生物学过程、分子功能和信号通路 (Pathway) 信

息，如转录调控活性 (GO: 0030528) 、转录调控 (GO:

0045449) 、 DNA 结合 (GO: 0003677) 、转录 (GO:

0006350) 和 DNA 依赖的转录调控 (GO: 0006355) 等出

现的频率很高，表明这些 GO 注释语句是爪蟾 bHLH

基因常见的功能。

同时，爪蟾 bHLH 转录因子家族的 GO 注释语句

显示，除了共同拥有的功能注释信息之外，一些重要

的发育过程或生理过程，如肌肉器官发育、神经管发

育、胚胎脊索发育、血小板、照相机型眼和普通眼的

发育、核内激素受体结合 (nuclear hormone receptor

binding) 和激素受体结合、感官发育及 Notch 信号通路

(notch signaling pathway) 等出现的频率也较高。另外，

6 大高阶组亦具有各个组内其自身的 GO 富集分布特

点。图 2 中显示的均为 GO 超几何分布中统计上显著

富集的功能注释 ( P < 0.05 ， FDR < 0.05) 。

3.3. 脊椎动物和无脊椎动物中 bHLH 基因数目

和分布特点的比较及 Hes 基因家族的进化

为了解蟾蜍类与其他动物基因组 bHLH 转录因子

的差异，我们比较了脊椎动物和无脊椎动物基因组中

bHLH 基因数目及其分布。脊椎动物的 bHLH 基因数

明显地比无脊椎动物的要多 ( 表 2) 。有些基因家族，如

E12/E47 、 NeuroD 、 Atonal 、 Mesp 、 Twist 、 Paraxis 、

SCL 、 SRC 、 Myc 、 Mad 、 MITF 、 HIF 、 Emc 、 Hey 和

Coe 等在脊椎动物是多基因家族，而在无脊椎动物中

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Table 2. Comparing the number of bHLH transcription factors found among vertebrate and invertebrate species

表 2. 脊椎动物和无脊椎动物中 bHLH 基因数目和分布特点之比较

Family Group Drosophila Lancelet Giant owl limpet Xenopus Laevis ChickenZebrafish Rat Mouse

ASCa A 4 3 6 2 2 2 2 2

ASCb A 0 1 1 2 2 3 3 3

MyoD A 1 4 1 7 4 4 4 4

E12/E47 A 1 1 4 2 5 5 4 4

Ngn A 1 1 3 3 2 2 3 3

NeuroD A 0 1 1 2 3 5 4 4

Atonal A 3 1 2 3 3 4 2 2

Mist A 1 1 1 nf 1 1 1 1

Beta3 A 1 1 2 nf 2 3 2 2

Oligo A 0 2 3 nf 2 4 3 3

Net A 1 1 2 nf 1 1 1 1

Delilah A 1 1 0 nf 0 0 0 0

Mesp A 1 1 0 7 4 5 3 3

Twist A 1 1 2 2 4 3 2 2

Paraxis A 1 2 1 2 3 4 2 2

MyoRa A 1 4 1 1 2 2 2 2

MyoRb A 0 1 1 nf 1 2 2 2

Hand A 1 1 1 3 2 1 2 2

PTFa A 1 1 1 nf 1 1 1 1

PTFb A 2 3 1 nf 1 2 1 1

SCL A 1 1 5 1 2 3 3 3

NSCL A 1 1 1 2 2 1 2 2

SRC B 1 1 0 3 3 3 3 3

Fig α B 0 1 0 1 0 1 1 1

Myc B 1 1 1 5 3 6 4 4

Mad B 0 1 1 5 3 4 4 4

Mnt B 1 1 1 1 1 2 1 1

Max B 1 1 1 2 1 1 1 1

USF B 1 1 2 3 1 2 2 2

MITF B 1 1 1 1 3 5 4 4

SREBP B 1 1 1 1 2 2 2 2

AP4 B 1 1 1 nf 0 1 1 1

MLX B 1 1 7 nf 3 1 2 2

TF4 B 1 0 1 nf 1 1 1 1

Clock C 3 1 2 1 3 3 2 2

ARNT C 1 1 0 3 2 2 2 2

Bmal C 1 1 0 2 2 2 2 2

AHR C 2 1 1 2 3 4 2 2

Sim C 1 1 1 1 2 2 2 2

Trh C 1 1 0 nf 1 2 1 1

HIF C 1 1 1 4 2 6 4 4

Emc D 1 1 2 5 4 5 4 4

Hey E 1 1 1 1 2 4 4 4

H/E(spl) E 11 11 12 15 6 15 8 8

Coe F 1 1 1 3 3 5 4 4

Orphan ? 0 6 4 nf 4 2 4 4

Total 59 78 82 98 104 139 114 114

注释：

表示某基因家族在有关的研究报道中没有被发现。表中各物种 bHLH 基因数据来自参考文献 [11,13-18] ，其中基因家族排列

的先后顺序参照了 Ledent et al. (2002) [11] 。

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注释： Hes 基因家族的最大似然估计进化树序列分别来自于人、小鼠、大鼠、斑马鱼、鸡和个非洲爪蟾，斑马鱼的 HEYL 作为外群

(Out-group) 。图中各分支上的数字为最大似然估计所得自展值 (Bootstrap values) 。此进化树表明， Hes 家族成员的 Hes1 、 Hes2 、 Hes3 、

Hes5 、 Hes6 和 Hes7 基因均有各自的进化起源和祖先基因。

Figure 3. Phylogenetic tree of the H/E(spl) family

图 3. 脊椎动物 Hes 基因家族的系统进化分析

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