PE150
信息分析内容
1、基本数据统计
数据过滤，对原始数据进行去除接头污染及低质量reads的处理
数据搭建，数据拼接，消除测序背景及有效数据构建
数据统计，数据产出统计及测序数据的成分和质量评估
2、数据比对分析
比对分析，与数据库V/D/J基因片段比对
比对结果统计
3、克隆序列特征注释
CDR3区核酸序列和氨基酸序列
鉴定无效序列（包含终止密码子，超出结构范围）
鉴定单碱基突变（替换、删除、插入）（for BCR）
4、单样品克隆群体特征分析
CDR3序列长度分布
V/J基因频率分布
V-J基因组合频率分布（3D, Circos）
克隆群体结构分析（频率分布，D50曲线，甜甜圈图）
5、样品间比较分析
测序饱和度分析
克隆多样性分析(辛普森系数、香农威纳系数等)
样品间共有克隆分析
聚类分析（层次聚类，MDS聚类）
组间差异分析
肿瘤案例： TCR克隆异质性与新抗原异质性及肺癌复发的关系
Cancer Discovery
. 2017
Oct;7(10):1088-1097.
研究目的
：寻找免疫检查点（PD-1、CTLA-4）治疗疗效的biomarker
研究样本
：11例未转移肺腺癌，共45 tumor regions (2 to 5 regions per tumor)
研究技术
：WES、TCR sequencing
研究结果
：病灶特有突变导致新抗原（neoantigen）的内部表达差异，因此，产生不同的免疫原性，形成了TIL克隆内部差异（TCR ITH）。TCR ITH（intratumor
heterogeneity）高与术后疾病复发和低生存率有关。
图1 TCR克隆异质性（ITH）与肺腺癌基因组和临床的相关性
（A）年龄与MOI相关性；（B）新抗原与MOI负相关；（C）复发的病人具有更高的TCR ITH（lower MOI）；（D）MOI越高（TCR克隆多样性越低），病人的无病生存期（disease-free survival）越长。MOI：克隆重叠指数，范围0-1，0代表克隆完全不同，1代表克隆完全相同。
感染类疾病案例：TCRβ序列特征可准确预测CMV感染状态
Nature Genetics
. 2017, 49(5): 659-665.
研究目的
：确定是否可以用TCR特征预测CMV（巨细胞病毒）感染状态。
研究样本
：群体1：共计666个样本，其中289个CMV阳性，352个CMV阴性，40个感染状态未知；群体2：120个验证样本。
研究结果
：对289个CMV+和352个CMV-样本进行免疫组库测序，发现了CMV相关的TCRβ序列特征，并且利用TCRβ可以从666个研究样本和120个验证样本中，准确鉴定出CMV感染状态。研究还发现该群体的TCRβ与HLA-A或HLA-B显著相关。
图2 TCRβ可预测CMV感染状态
（a）CMV+和CMV-样本中unique TCRβ分布散点图。（b）ROC曲线显示TCRβ作为CMV感染状态分类器的分类效果。其中虚线表示在群体1中的测试结果，短虚线代表群体1中的交叉验证效果，实线代表群体2中独立验证效果。每条线上的黑圈代表最大后验概率（MAP）的决定阈值。插入图表展示的是群体2中MAP分类效果，敏感度为0.90，特异性为0.89。
自身免疫性疾病案例：杀伤T细胞的突变积累可能与类风湿性关节炎发病有关
Nature Communications
. 2017, 8:15869.
研究目的
：大颗粒淋巴细胞白血病（LGL）常合并发生类风湿性关节炎（RA），研究发现LGL病人的CD8+ T细胞克隆存在STAT3突变，而拥有该突变的LGL病人更容易并发RA（43% vs.
6%）。因此推测，发生体细胞突变的CD8+ T细胞可能与RA发病有关。
研究样本
：82例新诊断未治疗的RA病人，20例健康人，取外周血。
研究结果
：首次采用CD4+ T细胞做对照，过滤生殖系突变（germline mutations），对分选的T细胞进行目标区域测序、外显子测序和TCR β链CDR3测序。发现，大约20%（5/25）病人的CD8+ T细胞有体细胞突变（somatic mutations），而CD4+ T细胞没有，RNA-seq确认了突变基因在CD8+ T细胞中高表达。功能分析发现，这些基因突变与免疫调控、细胞增殖有关，因此推测，发生体细胞突变的CD8+ T细胞可能与RA及其他自身免疫性疾病的发病有关。
图3 病人1中CD8+ T细胞的克隆分布及突变
（a）利用TCR测序获得的CD8+ T细胞克隆分布。（b）病人1中存在两个高频克隆，经过免疫抑制治疗后仍高表达。（c）利用扩增子测序，在流式分选后的亚群中进行突变验证。（d）本文研究思路图。
华大基因已发表IR-seq相关文章
IMPre: An Accurate and Efficient Software for
Prediction of T- and B-Cell Receptor Germline Genes and Alleles from
Rearranged Repertoire Data
Characterization of the B Cell Receptor Repertoire in
the Intestinal Mucosa and of Tumor-Infiltrating Lymphocytes in Colorectal
Adenoma and Carcinoma
≥ 1 mL全血收集的淋巴细胞or ≥ 1 mL Paxgene Blood RNA tube / RNAprotect® Animal Blood Tubes收集的全血
注意：对于组织样品，若淋巴细胞含量低，存在扩增不出来的状况。
Q1： TCR和BCR各条链编码基因的区别？推荐哪条链？
TCR Beta链和BCR重链是由V、D、J基因编码的，而TCR alpha链和BCR轻链是由V、J基因编码的。从发表文章来看，研究TCR
beta链和BCR重链的比较多。
Q2：免疫组库测序可以区分IgG、IgM、IgD、IgE吗？
免疫球蛋白的亚型，通过C区序列可以区分，华大有相应的引物，但必须是RNA样品。利用多重PCR的方法，利用V区-C区的引物，用约30bp的序列区分。产物长度大约是在200-300bp。
Q3：免疫组库的测序深度？能得到多少序列？
分析数据显示，数据量的增加，主要影响低频克隆，并且这些克隆的排序在一千多到九千不等，而研究往往只关注top100的克隆和疾病的关系，所以推荐起始数据量1G raw data。但如果客户想关注更多低频克隆，可以加大测序数据量。
Q4：做免疫组库测序，用基因组DNA做模板好，还是RNA好？
DNA水平侧重于研究基因重组信息，RNA水平侧重于研究基因的表达状态。使用DNA和RNA做模板各有优缺点:
gDNA的优点是：
1）因为每个基因只有两个拷贝，因此可准确地反映免疫细胞受体的克隆数；
2）DNA更稳定，易储存。
缺点是：
1）由于copy数不高，模板含量低，因此可能需要更多的样品；
2）由于J区和C区之间有很大的intron区，受测序长度的局限，缺少特异性扩增引物来扩增CDR全长。
RNA的优点是：
1）J区和C区之间无intron，可用C区进行引物设计，扩增全长CDR；
2）由于表达丰富，模板含量高，样品消耗量少。
缺点是：
1）免疫细胞受体的克隆性受到mRNA表达高低的影响，不能客观地反应本身的克隆数；
2）RNA不如DNA稳定，样品保存和操作要求较高。
