LIU Dan, ZHOU Qian, KONG Xiangyu, HU Chunmei, HOU Xilin, WANG Jianjun

不结球白菜花青苷合成转录因子基因 BcEGL3 的克隆及沉默分析

Cloning and gene silencing of an anthocyanin synthesis regulatory gene BcEGL3 in non-heading Chinese cabbage

南京农业大学学报, 2021, 44(2): 249-258

Journal of Nanjing Agricultural University, 2021, 44(2): 249-258.

http://dx.doi.org/10.7685/jnau.202006016

1. 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室/园艺作物种质创新与利用教育部工程研究中心, 江苏 南京 210095;
2. 南京农业大学 连云港新农村发展研究院, 江苏 连云港 222002 摘要 ： [目的] 本文旨在探究 BcEGL3 基因在不结球白菜紫色材料和其绿色突变体中的特性及其调控功能。 [方法] 以不结球白菜紫色自交系NJZX1-3和其绿色突变体 NJZX1-0 为材料，克隆 BcEGL3 基因；构建表达载体pRI101- BcEGL3 ，进行亚细胞定位；构建沉默载体pTY- BcEGL3 ，分析材料中花青苷含量变化，以及 BcEGL3 、 BcDFR 基因在NJZX1-3、 NJZX1-0 、pTY-S和pTY- BcEGL3 植株的基因表达量；对NJZX1-3进行遮光处理，分析遮光后花青苷的积累以及 BcEGL3 基因的转录水平变化。 [结果] 从NJZX1-3和 NJZX1-0 中克隆所得 EGL3 基因序列完全相同，序列长1 821 bp，含1个1 818 bp的开放阅读框（ORF），编码606个氨基酸，将其命名为 BcEGL3 。蛋白结构分析表明，EGL3蛋白属于bHLH-MYC-N超家族，其蛋白结构较为简单。进化树结果表明，BcEGL3蛋白与大白菜BraEGL3关系最近，同源性高达99.9%。亚细胞定位结果显示，BcEGL3蛋白定位于细胞核中。基因沉默结果表明，与NJZX1-3相比，转pTY- BcEGL3 或pTY-S植株叶片紫色变浅，且对应花青苷含量降低。RT-qPCR结果表明， BcEGL3 和 BcDFR 基因在转pTY- BcEGL3 植株中的相对表达量低于转pTY-S植株和NJZX1-3植株，同时植株叶片颜色由紫色转为绿色，花青苷含量明显降低，但总叶绿素含量及类胡萝卜素含量无明显变化。遮光处理5 d后不结球白菜叶片中花青苷的含量比对照下降68%，且11 d时叶片中花青苷含量降幅最大。另外，遮光后 BcEGL3 基因相对表达量呈下降趋势，与对照相比14 d时下降幅度最大。 [结论] BcEGL3蛋白定位于细胞核， BcEGL3 基因沉默可以抑制叶片中花青苷的合成，且与 BcDFR 基因的表达密切相关，因此在不结球白菜花青苷的合成过程中 BcEGL3 基因起重要作用。 关键词 ： 不结球白菜 BcEGL3 基因 亚细胞定位 花青苷 基因沉默 Cloning and gene silencing of an anthocyanin synthesis regulatory gene BcEGL3 in non-heading Chinese cabbage 1. State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops(East China), Ministry of Agriculture and Rural Affair/Engineering Research Center of Germplasm Enhancement and Utilization of Horticultural Crops, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. Lianyungang New Rural Development Institute, Nanjing Agricultural University, Lianyungang 222002, China Abstract : [Objectives] This article aimed to explore the characteristics and regulatory functions of BcEGL3 gene in non-heading Chinese cabbage purple material and its green mutant. [Methods] In this experiment, the non-heading Chinese cabbage purple inbred line NJZX1-3 and its green mutant NJZX1-0 were used as materials to clone the BcEGL3 gene. Then BcEGL3 protein was analyzed for subcellular location by constructing the expression vector pRI101- BcEGL3 , and by constructing the silencing vector pTY- BcEGL3 , the changes of the anthocyanin content in the materials and the gene expression levels of BcEGL3 and BcDFR genes in NJZX1-3, NJZX1-0 , pTY-S and pTY- BcEGL3 plants were analyzed. In the end, by shading NJZX1-3 materials, the accumulation of anthocyanins and the changes in the transcription level of BcEGL3 gene were analyzed. [Results] The EGL3 gene sequence cloned from NJZX1-3 and NJZX1-0 was completely identical. The sequence was 1 821 bp in length, containing an open reading frame (ORF) of 1 818 bp, encoding 606 amino acids, and named BcEGL3 . The analysis of protein structure showed that EGL3 protein belonged to the bHLH-MYC-N super family, and its protein structure was relatively simple. The phylogenetic tree results showed that BcEGL3 protein had the closest relationship with BraEGL3 in Chinese cabbage, and the homology was as high as 99.9%. The results of subcellular localization showed that BcEGL3 protein was localized in the nucleus. The gene silencing results showed that, compared with NJZX1-3 plant, the leaves of transgenic pTY- BcEGL3 or pTY-S plants became lighter in purple and the corresponding anthocyanin content decreased. RT-qPCR results showed that the relative expression levels of BcEGL3 and BcDFR genes in pTY- BcEGL3 plants were lower than those in transgenic pTY-S and NJZX1-3 plants, and the color of plant leaves changed from purple to green, and the anthocyanin content significantly decreased. But the total chlorophyll content and carotenoid content did not change significantly. The anthocyanin content in non-heading Chinese cabbage leaves decreased by 68% compared with the control after shading treatment for 5 days, and the anthocyanin content in leaves decreased the most on 11 days. In addition, the BcEGL3 gene showed a downward trend after shading, with the largest decline at 14 d compared with the control. [Conclusions] BcEGL3 was located in the nucleus. BcEGL3 gene silencing could inhibit the synthesis of anthocyanins in leaves, and was closely related to the expression of BcDFR gene, and played an important role in the process of non-heading cabbage anthocyanin synthesis. Keywords : Brassica campestris ssp. chinensis BcEGL3 gene subcellular localization anthocyanin gene silencing

不结球白菜( Brassica campestris ssp. chinensis )富含对人体有利的维生素C、粗纤维和花青苷, 紫色不结球白菜中的花青苷含量尤为丰富。花青苷是糖基化的多酚类化合物, 易溶于水, 是蔬菜和水果重要的呈色物质。花青苷能够保护植物抵抗各种生物和非生物胁迫 ^{[ 1 ]} , 花青苷在人体中还具有抗氧化 ^{[ 2 ]} 、抗癌 ^{[ 3 ]} , 降低血压 ^{[ 4 ]} 和血脂 ^{[ 5 ]} , 减缓阿尔兹海默症 ^{[ 6 ]} 等功效。

EGL3 ( Enhancer of Glabra 3 )基因属于Ⅲf亚类bHLH转录因子, 可以通过调控花青苷合成途径中某个结构基因, 实现对植物体内花青苷含量的调控作用。EGL3蛋白具有典型碱性螺旋环螺旋结构域, bHLH结构域具有2个不同的功能区域: HLH和BASIC ^{[ 7 ]} , 其中HLH可以促进蛋白互作, 形成同源二聚体或异源二聚体 ^{[ 8 ]} ; BASIC位于bHLH结构域的N末端, 与DNA顺式元件E-box(5′-CANNTG-3′)和G-box(5′-CACGTG-3′)结合调控基因的表达 ^{[ 9 ]} 。 DFR 基因是花青苷合成途径中结构基因。二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydrofavonol 4-reductase, DFR)是花青苷生物合成代谢中的关键酶, 影响花青苷的组成和色素沉着, 是植物呈色的关键酶, 也是花色形成的重要调控点。Danilo等 ^{[ 10 ]} 对缺失 DFR 基因的番茄纯合子的胚轴和愈伤组织进行体外培养, 之后对再生绿色小植株的胚轴和愈伤组织靶向插入 DFR 基因, 结果再生小植株由绿色转为紫色。于婷婷 ^{[ 11 ]} 在龙胆试验中检测发现, DFR 基因过表达的转基因橙花龙胆与野生型相比红色更深, 花青苷含量更高。Nesi等 ^{[ 12 ]} 发现在过表达 EGL3 的转基因拟南芥植株中, DFR 的表达量增加, 叶片由绿色转为紫色, 证明 EGL3 通过调控花青苷合成途径中 DFR 基因实现对花青苷的调控。 EGL3 基因还可与其他调控因子 PAP1 / 2 、 TTG1 一起形成复合体, 共同调控 DFR 基因的表达调控 ^{[ 13 ]} 。

本研究采用同源克隆方式以不结球白菜紫色自交系NJZX1-3及其绿色突变体 NJZX1-0 为材料克隆获得 BcEGL3 基因, 利用生物信息学方法分析其结构及保守域, 并预测其蛋白结构; 构建pRI101- BcEGL3 载体, 对BcEGL3进行亚细胞定位分析; 构建pTY- BcEGL3 沉默载体, 对 BcEGL3 基因进行功能验证; 对NJZX1-3进行遮光处理, 检测叶片花青苷含量以及 BcEGL3 基因的转录水平, 旨在为紫色不结球白菜中花青苷合成的分子调控机制奠定生物学基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

供试材料为不结球白菜紫色材料NJZX1-3及其经过秋水仙素诱导所产生的非加倍绿色突变体 NJZX1-0 ( 图 1 ), 由南京农业大学白菜系统生物学实验室提供。将不结球白菜种子先用体积分数为70%的乙醇杀菌消毒后, 再用超净水冲洗, 室温催芽2 d左右, 移至穴盘, 放置在气候室(光/暗时间为16 h/8 h, 光/暗温度为22 ℃/18 ℃)。另外, 取7叶期健壮NJZX1-3材料用遮阳网进行遮光处理, 分别在处理后0、3、7、11和14 d时取样, 每个处理设3次重复。以同期自然条件下生长的健壮幼苗为对照组。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

取0.1 g试验材料7叶期的叶片, 置于加入锆珠的2 mL磨样管中, 液氮速冻。用磨样机(程序为45 Hz 90 s)磨样完成后, 用RNA提取试剂盒(TaKaRa)提取RNA。使用Prime Script RT Reagent Kit(TaKaRa)合成cDNA, 用于 BcEGL3 基因的克隆。

1.3 BcEGL3 基因的克隆

在大白菜数据库(BRAD, http://brassicadb.org/brad/index.php )中, 查询 BcEGL3 同源基因 BraEGL3 (Bra027796)设计特异引物( 表 1 ), 并以反转录得到的第1链cDNA为模板, 进行cDNA克隆。PCR总体系为20 μL: 模板1 μL, 正、反引物各1 μL, I-5TtMn 2×High-Fidelity Master Mix酶(南京擎科生物科技有限公司)10 μL, ddH ₂ O 7 μL。设3个重复。反应程序: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 59.6 ℃ 30 s, 72 ℃ 2 min, 35个循环; 72 ℃ 10 min。PCR产物经15 g·L ^-1 凝胶电泳检测后, 回收目的片段, 经大肠杆菌转化后, 挑取单菌落送南京擎科生物科技有限公司进行测序。

表 1 本文所用引物序列 Table 1 Primer sequences in this study BcEGL3.1 -F/R TTCTTCACTGTTGATACATATGATGGCTACTGGAGAAAACAGAACCGTG/
TCGCCCTTGCTCACCATGGATCCACATATCCATGCAACTCTTTGAAG 荧光载体的构建
Construction of fluorescent vector BcEGL3 -A/S CAGAACCGTGCAGGAAAATCT/TCCATCTCCCCATTCCAGCA 检测 BcEGL3 的表达
The expression of BcEGL3 BcDFR -A/S CCAAGAAGATGACAGGAT/GTTACGAGTGATAGGAGAG 检测 BcDFR 的表达
The expression of BcDFR Actin -A/S GTTGCTATCCAGGCTGTTCT/AGCGTGAGGAAGAGCATAAC 内参基因
The internal gene 1.4 EGL3 基因序列及其蛋白的生物信息学分析

利用BioXM 2.6对EGL3进行ORF查找、翻译; 利用NCBI( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ )中的分析工具对EGL3蛋白质理化性质进行分析; 利用DNAMAN 7程序进行多重序列比对; 利用TMpred在线软件( https://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html )预测EGL3的跨膜结构; 利用MEGA 5程序构建系统进化树; 利用在线的SMART( http://smart.embl-heidelberg.de )进行结构域分析; 利用WebLogo( http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi )在线程序分析EGL3转录因子蛋白结构域的保守位点。

1.5 BcEGL3的亚细胞定位检测

设计2条特异性引物 BcEGL3.1 -R和 BcEGL3.1 -F, 以pEASY- BcEGL3.1 载体质粒为模板, 采用高保真酶扩增目标片段, 电泳检测后切胶回收。用限制性内切酶对表达载体pRI101进行双酶切。反应产物经凝胶(15 g·L ^-1 )电泳检测后, 胶回收酶切目的片段。用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司)同源重组上述胶回收片段, 经大肠杆菌转化后, 挑取单菌落送南京擎科生物科技有限公司进行测序, 返样后提取质粒, 于-70 ℃冰箱中保存备用。

将上述提取的质粒采用冻融法转化到农杆菌GV3101中, 均匀涂在含有卡那霉素(50 mg·L ^-1 )和利福平(50 mg·L ^-1 )的LB固体培养基上, 在28 ℃恒温培养箱中倒置培养。2 d后挑取单菌落于400 μL含卡那霉素和利福平的LB液体培养基的灭菌管中; 在28 ℃过夜摇菌, 将摇好的菌液转移到50 mL管中摇至菌液 D ₆₀₀ =1.0;6 000 r·min ^-1 离心5 min, 弃上清液, 用含10 mmol·L ^-1 MES、10 mmol·L ^-1 MgCl ₂ 和150 mol·L ^-1 的乙酰丁香酮注射缓冲液重悬菌液; 将菌液调至 D ₆₀₀ =0.8, 室温静置4 h; 将P19、RFP、 EGL3 基因按0.5∶1∶1的体积比混匀, 用1 mL灭菌的去掉针头的注射器, 注射种植时间为1个月的烟草叶片背面。将注射后的烟草置于气候室, 气候室条件为: 光/暗时间为16 h/8 h, 光/暗温度为22 ℃/18 ℃。3 d后利用激光共聚焦显微镜观察并拍照。

1.6 病毒诱导的基因沉默表达载体的构建

pTY- BcEGL3 的载体构建主要采用杨学东等 ^{[ 14 ]} 的方法。 BcEGL3 选取的40 bp序列为: 5′-TAAAGAAACACCTCGCAGTTTCAGTTCGAAACATTCAATG-3′, 在南京金斯瑞生物科技有限公司分别合成反向互补序列80 bp。pTY载体用 Nde Ⅰ酶切后, 用T ₄ 连接酶与合成好的DNA片段过夜连接, 转化大肠杆菌, 挑取阳性单克隆, 测序验证。提取pTY- BcEGL3 质粒, 用金粉包埋后, 用基因枪(1 000 psi)导入到7叶期的NJZX1-3中, 以pTY空载质粒的NJZX1-3(pTY-S)作为对照, 20 d后, 观察植株表型变化。选取pTY载体中的CP(coat protein)基因片段设计特异引物(CP-F: 5′-TCCACCCTCACCACCTTC-3′和CP-R: 5′-GGGACAGACCTCGCTAACT-3′), PCR检测转基因植株 ^{[ 15 ]} 。

1.7 不结球白菜总花青苷含量的测定

采用董慧杰 ^{[ 2 ]} 的方法并稍加改动。取冷冻干燥叶片0.1 g, 用液氮研磨后, 加入1.5 mL酸化乙醇(用体积分数为5%的HCl进行酸化), 在适当摇晃、避光条件下浸提24 h。

1.8 实时荧光定量PCR表达分析

根据克隆所得 EGL3 基因的cDNA全长序列, 采用在线软件Primer-BLAST设计正、反引物( 表 1 ), Actin 基因作为内参。试验步骤及用量参考SYBR Premix Ex Taq TMNJZX1-0Ⅱ(TaKaRa)试剂盒说明书。反应总体系20 μL: 模板1 μL, 正、反引物各0.5 μL, SYBR Premix Ex Taq 10 μL, ddH ₂ O 8 μL。采用2 ^{-ΔΔ C _T} 法 ^{[ 16 ]} 计算基因的相对表达量。每个反应设3次生物学重复。程序为标准的两步法, 在7500实时荧光定量PCR仪(美国AppliedBiosystems)上进行定量分析。

2 结果与分析 2.1 不结球白菜 EGL3 基因的克隆及序列分析

分别从NJZX1-3和 NJZX1-0 中分离出2个cDNA克隆片段, 测序结果( 图 2 )显示, 这2个片段的基因序列完全一致, 长1 821 bp, 将其命名为 BcEGL3 。核苷酸序列比对结果显示, BcEGL3 含有1个长为1 818 bp的开放阅读框(ORF), 编码606个氨基酸, 其中含酸性氨基酸63个, 碱性氨基酸84个。

2.2 BcEGL3蛋白的特征分析

对BcEGL3蛋白结构分析显示, 该蛋白的等电点为4.98, 分子结构式为C _5469H9119 N _1821O2289 S ₃₅₄ , 相对分子质量为6.795×10 ⁴ , 为亲水性蛋白。氨基酸组成中Ala(a)丙氨酸所占比例最大。保守域分析结果表明, EGL3蛋白属于bHLH-MYC-N超家族。利用在线软件SOPMA预测 EGL3 编码蛋白二级结构, 结果表明( 图 3 ), EGL3含有 α -螺旋236个(38.94%), 无规则卷曲281个(46.37%), 含有 β -转角23个(3.80%)和延伸链66个(10.89%)。EGL3蛋白的三级结构( 图 4 )的预测结果与二级结构的基本相符。

图 3 BcEGL3蛋白的二级结构 Fig. 3 The predicted secondary structure of BcEGL3 protein 图中蓝色为 α -螺旋, 红色为 β -折叠, 绿色为 β -转角, 紫色为无规则卷曲。 In figure, blue represents alpha helix, red represents beta folding, green represents beta corner and purple represents irregular curling. 图 5 BcEGL3蛋白和其他物种EGL3蛋白的同源性比较 Fig. 5 Homologous alignment of amino acid sequences of BcEGL3 and EGL3 in other species 1.不结球白菜 Brassica campestris ssp. chinensis ; 2.大白菜 Brassica rapa ssp. pekinensis (XM_009114683.2);3.甘蓝 Brassica oleracea (XM_013751484.1);4.萝卜 Raphanus sativus (XM_018597840.1);5.琴叶拟南芥 Arabidopsis lyrata subsp. lyrata (XM_021010124.1);6.亚麻芥 Camelina sativa (XM_010475309.2);7.拟南芥 Arabidopsis thalian a(NM_001198373.2). 图 8 BcEGL3 基因沉默后不结球白菜植株表型对比 Fig. 8 Phenotypic comparison of plants after BcEGL3 gene silencing in Brassica campestris ssp. chinensis pTY-S和pTY- BcEGL3 分别表示转pTY-S和pTY- BcEGL3 的植株。下同。 pTY-S and pTY- BcEGL3 indicate transgenic pTY-S and pTY- BcEGL3 plants, respectively. The same as follows.

BcDFR 基因相对表达量由大到小依次为: NJZX1-3、转pTY-S植株、转pTY- BcEGL3 植株、 NJZX1-0 , 其中转pTY- BcEGL3 植株比转pTY-S植株降低61.62%, 说明 BcEGL3 基因的沉默会使 BcDFR 基因表达量下降, 进而影响不结球白菜花青苷的含量及叶片的颜色变化。

2.8 遮光后不结球白菜花青苷含量及 BcEGL3 基因表达分析

由 图 11 可见: 遮光3 d后不结球白菜叶片中花青苷含量开始下降, 5 d时比对照降低68.39%;在11 d时叶片中花青苷含量下降幅度最大, 比对照降低76.04%。另外, 遮光后 BcEGL3 基因相对表达量呈下降—上升—下降的变化趋势, 与对照相比在3和14 d时下降幅度最为明显, 分别下降75.62%和79.24%。

bHLH转录因子是真核生物中存在最广泛的一大类转录因子 ^{[ 17 ]} , 在植物激素响应、光形态发生和花器官发育等多种生理过程中具有重要的调控作用 ^{[ 18 ]} 。它可以与MYB转录因子和WD40蛋白形成三元复合体, 协同调控花青苷生物合成途径结构基因的表达, 进而调控花青苷的积累 ^{[ 19 ]} 。在拟南芥中bHLH类转录因子EGL3、GL3、TT8通过和TTG1以及MYB类转录因子TT2或PAP1互作来实现对花青苷结构基因的调控 ^{[ 20 ]} 。本研究中在NJZX1-3和 NJZX1-0 中克隆获得序列一致的 BcEGL3 基因, 序列长1 821 bp, 编码606个氨基酸。蛋白结构分析表明, EGL3蛋白属于bHLH-MYC-N超家族。进化树结果表明, BcEGL3蛋白与大白菜BraEGL3关系最近, 同源性高达99.9%。亚细胞定位结果显示, BcEGL3蛋白定位在细胞核内, 说明该蛋白在细胞核中发挥功能。据报道, 花青苷的生物合成易受光照条件的影响, 在光照条件下MS培养基上的拟南芥幼苗中花青苷的合成增加 ^{[ 2 ]} 。在本研究中, 遮光处理5 d后的NJZX1-3叶片中花青苷含量明显低于对照, 而 BcEGL3 基因在遮光处理后表达量都低于对照组。由此推断, 遮光在一定程度上抑制 BcEGL3 基因的表达从而抑制花青苷的合成。

调节花青苷生物合成的bHLH转录因子大多属于Ⅲf亚类, 通过抑制或者过表达花青苷合成相关的 bHLH 基因来影响植物体内花青苷的积累 ^{[ 21 - 22 ]} 。病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术是转录后的基因沉默方法, 常用作对特定基因功能的研究, 现已广泛应用于反向遗传学研究 ^{[ 23 ]} 。目前VIGS技术已经应用到许多植物中, 例如用VIGS技术沉默小麦淀粉合成的调控转录因子基因 WSR1 后, 籽粒内支链淀粉、总淀粉和抗性淀粉含量显著增加, 表明 WSR1 基因负向调控小麦的淀粉合成 ^{[ 24 ]} 。用VIGS技术对‘澳洲青苹’果实Homeobox 1转录因子基因 MdHB-1 沉默后, 果实的呼吸强度和乙烯释放速率受到显著抑制, 果实硬度、可溶性固形物和可滴定酸质量分数的下降延缓, 证明 MdHB-1 基因参与果实的成熟衰老过程 ^{[ 25 ]} 。本试验结果显示, 在沉默转基因植株中 BcEGL3 基因表达量较转pTY-S植株降低75.64%, 沉默效果与杨学东等 ^{[ 14 ]} 沉默白菜八氢番茄红素脱氢酶基因( BcPDS )的效果基本一致。这表明在NJZX1-3材料中 BcEGL3 基因的表达得到有效抑制, 沉默转基因植株中花青苷的积累降低, 叶片颜色由紫色变为绿色。与NJZX1-3相比，转pTY-S植株花青苷含量降低38.11%, 由此推断, 病毒会使天然色素发生少量降解; 叶片颜色可能与花青苷和叶绿素含量的比值有关; BcEGL3 基因能正向调控总花青苷的积累, 但对总叶绿素和类胡萝卜素的积累无影响。本研究还发现, 在沉默转基因植株中 BcDFR 基因表达量与 BcEGL3 基因的表达量正相关, 表明 BcEGL3 可能是通过调控 BcDFR 基因的转录水平进而影响花青苷的积累。

综上所述, 本试验通过荧光定量PCR、亚细胞定位、遮光处理及基因沉默等方法对 BcEGL3 基因的功能进行探索和验证, 结果表明BcEGL3位于细胞核, 遮光会抑制 BcEGL3 基因的转录水平。另外, BcEGL3 基因沉默可以降低 BcDFR 基因的表达, 进而影响不结球白菜紫色材料中花青苷的积累及植株叶片紫色的呈现。下一步我们将从分子水平进一步解析花青苷的合成机制, 为改善紫色不结球白菜优良性状, 提高其品质提供理论基础。

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