2 结果

3 讨论

近年来，免疫疗法在肺癌患者的治疗中得到了广泛的应用。然而，仍有一些患者对免疫治疗存在原发性耐药，或者在免疫治疗过程中出现获得性耐药。PD-1阻断疗法的耐药机制尚未得到很好的阐明，可能涉及多种因素，包括异常肠道微生物组成以及抗原呈递功功能的缺失等。因而，需要有生物标志物以便能有效地预测肺癌患者对PD-1阻断治疗的疗效 ^{[ 15 , ⇓ - 17 ]} 。肿瘤组织PD-L1的表达强弱是目前已明确的NSCLC免疫治疗的预后因素。除外PD-L1，其他一些分子标志物包括TMB、肿瘤微环境、组织基因表达谱等仍在研究中，然而，这些标志物需通过有创操作获取肿瘤组织，成本较高且在动态监测方面具有一定的局限性。因此，迫切需要外周血生物标志物以便能更快捷、有效地预测肺癌患者对PD-1阻断治疗的疗效。

本研究结果显示，肺癌患者外周血中预先存在较高水平的Th1细胞因子，如IFN-γ、TNF-α和Th2细胞因子IL-5，可能提示对PD-L1/PD-1阻断治疗有更好的临床应答。从机制上来说IFN-γ是通过增强自然杀伤细胞以及T细胞的细胞毒性和增强树突状细胞功能等几方面来调节天然免疫应答和适应性免疫应答来增强患者抗肿瘤免疫反应 ^{[ 18 ]} 。同样，TNF-α在肿瘤微环境中通过招募和激活中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞，从而发挥抗肿瘤免疫应答的作用 ^{[ 19 ]} 。既往有研究 ^{[ 20 ]} 表明在免疫治疗前和治疗开始后3个月，IFN-γ和TNF-α细胞因子水平的增加与NSCLC免疫治疗反应的改善和总生存期（overall survival, OS）延长有关。而本研究结果表明，预先存在的细胞免疫应答可能有助于PD-1抗体发挥较强和持久的免疫反应。肿瘤免疫主要由Th1介导的细胞免疫介导，这能解释为什么较高的IFN-γ和TNF-α细胞因子水平与更好的预后相关。同时，本研究也观察到，预先存在较高水平的IL-5与更好的临床应答相关。IL-5主要由Th2淋巴细胞和2型固有淋巴细胞（group 2 innate lymphoid cell, ILC2）产生。它可以通过促进B细胞的分化和生长来增加抗体分泌，并增强支持抗体应答的体液免疫应答 ^{[ 21 ]} ，从而更好地协同细胞免疫应答发挥作用。本研究还发现治疗后患者血清IL-5和IL-10水平的升高提示与抗PD-1单克隆抗体治疗的疗效有关。这可能提示，细胞因子水平的动态变化与治疗的客观反应率也有一定的关联。此外，研究还观察到在免疫治疗过程中肿瘤进展患者的总淋巴细胞绝对计数明显减少， 这也有助于我们早在影像评估之前识别那些未能从免疫治疗中获益的人群。

肿瘤微环境中的CD8 ⁺ T细胞和CD4 ⁺ T细胞免疫在介导持久抗肿瘤反应中发挥重要作用。研究 ^{[ 22 ]} 表明，外周血中的中央记忆CD4 ⁺ T细胞可以作为恶性黑色素瘤患者对PD-1阻断治疗临床反应的预测指标。本研究观察到CD4 ⁺ T细胞上CD45RO ⁺ CD62L ⁺ （中央记忆表型）/CD45RO ⁺ CD62L ^- （效应记忆表型）比率较高的患者与PD-1阻断的临床疗效有一定关联，但无明显差异，这可能是由于样本数相对较少、数据偏倚等所致，后续需要更大样本量的验证。此前的研究表明，CD27配体CD70表达于树突状细胞表面，是CD8 ⁺ T细胞有效活化和发挥抗肿瘤免疫应答所必需的 ^{[ 23 , ⇓ , ⇓ , ⇓ , ⇓ - 28 ]} 。然而，本研究基线时外周血中CD8 ⁺ CD27 ⁺ T细胞比例与临床反应呈负相关。但事实上，之前有研究 ^{[ 29 ]} 通过供体淋巴细胞过继输注的动物模型发现CD8 ⁺ T细胞因持续暴露于抗原后因活化而耗尽，通过激动剂抗CD27和抗PD-L1的组合可以实现短暂的CD8 ⁺ T淋巴细胞功能恢复。这可能是耗竭的CD8 ⁺ CD27 ⁺ 细胞对PD-1阻断缺乏应答的原因之一。

有研究 ^{[ 30 , ⇓ , ⇓ , ⇓ - 34 ]} 表明在CD8 ⁺ T细胞表面未检测到明显的与治疗或应答相关表型差异，包括PD-1以及PD-L1，这和本研究结果相一致。然而，也有研究 ^{[ 35 ]} 表明，PD-1阻断治疗后PD-1 ⁺ CD8 ⁺ T细胞的早期增殖与临床应答相关，外周血细胞上PD-1的表达可能提示肿瘤反应性T细胞的富集。针对PD-L1在外周血细胞上的表达，有一项对32例接受PD-L1/PD-1阻断治疗的NSCLC患者的研究结果 ^{[ 36 ]} 提示在应答者和无应答者之间PD-L1 ⁺ CD11b ⁺ 髓系细胞群体的百分比存在显著差异，基线时PD-L1 ⁺ CD11b ⁺ 细胞百分比>30%的患者显示出更高的临床应答率。然而，本研究并未观察到外周血中CD33 ⁺ CD11b ⁺ PD-L1 ⁺ 细胞的表达对PD-1/PD-L1阻断治疗有预测价值，这也提示在分析外周血中的这些标志物时，应考虑比肿瘤环境更复杂的详细的分子标志物组合以及门控分析策略。此外，除了PD-1或PD-L1细胞的绝对数量外，肿瘤抗原特异性免疫细胞的TCR多样性和特异性也可能在预测中发挥重要作用。已有研究 ^{[ 31 , 37 , 38 ]} 表明，外周PD-1 ⁺ CD8 ⁺ T细胞的TCR多样性和新抗原特异性CD8 ⁺ T细胞在预测抗PD-1/PD-L1对于NSCLC治疗的临床疗效方面有一定价值，这也为我们后续进一步的深入研究提供了一定的思路。

本研究有几个局限性。首先，这是一项回顾性的单中心研究，入选的患者数量相对较少，治疗前后配对的患者样本量有限，并且入组患者包括鳞癌、腺癌、SCLC等多种肺癌亚型，其生物学特性有着一定差异，未进一步分析血清指标的变化和不同病理亚型的肺癌疗效之间的相关性，我们在后续的研究中也将进一步扩大样本量以及进行亚组分析进一步明确；第二，本研究将所有接受PD-1/PD-L1抗体治疗的患者纳入研究，其中包括大部分联合化疗的患者，但并没有设立仅接受化疗的对照组。因而，细胞因子水平或免疫细胞表型可能受化疗药物的影响，并不能纯粹归因于免疫治疗；第三，这些参数的截断（cut-off）值没有进一步确定，不同的cut-off值可能会对结果产生影响；第四，该研究包括了一部分SCLC患者，其生物学性质以及对免疫治疗的应答模式与NSCLC也有着较大差异，可能会对研究结果造成一定影响和偏倚；第五，在这项研究中，1/3的患者作为二线或二线后治疗接受PD-1抑制剂，因而基线血液标志物可能受到先前治疗（包括化疗、靶向或其他治疗）的影响。尽管存在这些局限性，这项研究仍是首次确定晚期肺癌患者基线Th1/Th2细胞因子水平和抗PD-1/PD-L1阻断性抗体治疗疗效有关，并初步探索了这些细胞因子在外周血的动态变化趋势与免疫治疗疗效的关系。

总之，本研究初步表明，肺癌患者基线血清IFN-γ、TNF-α和IL-5水平可以预测抗PD-1阻断治疗的临床疗效，且治疗后IL-5和IL-10的上调可能预示更好的临床应答，而免疫治疗后外周血总淋巴细胞计数的减少可能预示预后的不佳。此外，CD4 ⁺ CD45RO ⁺ CD62L ⁺ /CD4 ⁺ CD45RO ⁺ CD62L ^- 亚群的比率较高似乎与较好的临床应答有关。大型前瞻性研究有待进一步阐明这些生物标志物的价值。相信这些外周血生物标志物可以帮助临床中更早期识别能够从抗PD-1/PD-L1免疫治疗中获益的优势人群。

The authors declare that they have no competing interests.

Wang LF and Liu BR conceived and designed the study. Su S, Lv X and Wei M performed the experiments and analyzed the data. Qi L contributed analysis tools. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.