生物通报道:实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,QPCR)技术使mRNA定量、基因分型（genotyping）和微列阵数据检验变得简单智能。但是“简单”也只不过是赞美，真正进行QPCR时，其中的缺陷接踵而来。引物和探针设计、样本制备和选择控制（control selection）标准化都是一些潜在的障碍。修斯顿Texas大学保健科学中心Quantitative Genomics核心实验室主任Greg Shipl说，“需要进行许多虚拟工作”，从确定靶基因是否有突变到保证靶基因的特异性。
1 标准是否符合实际？
I-Hsiung Brandon Chen以前在加州Scripps研究所，利用罗氏LightCycler 2.0和SYBR Green chemistry，建立RT-QPCR分析技术，验证DNA芯片收集的基因表达分析资料。Chen 说：“在实现标准化的过程中，我认为最常见的问题是选择对所有基因进行规范化的最佳内参基因。我需要进行六次检测，才能筛选出1个或2个比较稳定的（内参基因），其它4个会随着处理发生变化。” 目前还没有设计内参的标准。怎样选择符合实际的内参？
不幸的是反复实验以内参为标准，宾州大学Huck研究所生命科学核酸设备研究计划主任Deborah Grove说。对每个经过处理的样本的一部分进行检测，观察预期表达稳定的转录本（如看家基因GAPDH或者beta-actin），如果确实是稳定的，即相对于添加的RNA量而言，QPCR测量的转录本含量在所有样本中都恒定，那么这种内参是成功的，如果不是则还需继续寻找。爱荷华州立大学DNA facility主任Kevin Knudtson认为，即使有一种标准化内参，还是不够的，“至少有两个评价指标,才会对规范有效有更多的信心。”
2 RNA降解了吗？
密歇根大学医学院分子和行为神经科学研究所的研究人员Ilan Kerman，希望利用QPCR确认微列阵来源的基因表达的变化情况。Kerman的样本是人脑mRNA（采自于激光微分离出的一小部分细胞），不尽如人意。一些RNA提取于脑死亡和获取组织后的20到25小时内，RNA通常在这个时间段发生降解。“我们知道它们比常规手段处死的小鼠的RNA降解的要快。”另外， Kerman需要核实的基因表达量的变化范围为20－90％。
Toledo大学医学生理学博士James Willey认为，Kerman遇到的问题有两个：RNA降解和RNA含量太低。“就对RNA质量的要求而言，QPCR比其它现有的基因表达检测方法要低。”Willey在一封电子邮件中写道，“特别是设计小片段PCR扩增子（比如，不到150bp）”。另外，不同的基因降解速率不同。
Willey建议首先在凝胶中检测RNA的质量。“跑总RNA的电泳，如果两种核糖体条带能够完全分开，或者RNA完整值（RNA integrity number，RIN）很高（与安捷伦描述的一样），有可能得到可信的QPCR结果。如果不出现任何核糖体条带，或者RIN很低，为样本质量确立基因特异性标准就很必要。”至于RNA数量，他认为利用低量模板，随机采样误差会引起扩增循环数（cycle threshold，Ct）值出现大的变动。“高扩增循环数（比如，34或者35以上）有许多潜在原因，”比如低模板数和基因特异的抑制剂。区分这两个原因，他建议在每次分析过程中，加入一定数量的内参分子。
3 怎样检测低拷贝数模板？
爱荷华州立大学博士后Jill Petrisko，利用TaqMan chemistry和Cepheid SmartCycler II对大米真菌感染进行定量，准备时间花了数月。Petrisko说： “我遇到的一个问题是实验使用的是单拷贝基因。在线性的实验过程中，检测真菌DNA真的很困难。”为了将循环数限制在20－30，她首先溶解、浓缩DNA以提高反应的模板量，问题虽然解决了，但reproducibility随之降低。最终，她更换了引物，检测多拷贝靶标。
“对于低拷贝量的样本，我拭图增加拷贝量，”Knudtson说，或者通过延长逆转录酶作用的时间（扩增mRNA时），或者通过加大反应体积。“许多试剂盒的反应体积都是50ml，”Knudtson说，许多研究人员为了节省成本，使用20－25ml体积，“但如果保持50ml甚至100ml，会添加更多的模板”当然会增加花费，Knudtson说：大体积出产高质量。
4 阴性结果真的是阴性结果吗？
加拿大食品安全检验局分子生物学家Margaret Green利用罗氏LightCycler 1.5和TaqMan 、SYBR Green chemistries，对DNA进行QPCR。“我正在利用发展中的检测技术，对各种靶标进行检测，”Green说在一间诊断实验室里，将低拷贝的阳性样本从真正的阴性样本中区别出来非常重要。“如果一个样本的新Ct值（比如大于37），能说明它是阴性的吗？”
Shipley在一封电子邮件中写到：“对于我来说，Ct37或以上，是不信的，因为这比一个模板分子的误差还要小。”100 bp的单拷贝扩增子经过35、36个循环可以检测到，预期化验经过几个几乎完美的斜率（slope），可以转变为几乎100％的PCR效果。（随着斜率上升，Ct值也会增长，他强调说）。“考虑到这个问题，寻找这些值以下的阳性结果是没有意义的。”Grove建议上调反应模板，进行非模板的对照反应。
5 有抑制剂怎么办？
爱荷华州立大学微生物副教授Malcolm Shields，利用QPCR检测、估计环境样本中的细菌种类。Shields说：利用MJ Research Chromo4系统和SYBR Green chemistry“我们准备对一些粗样――污水进行QPCR。” Shields遇到的麻烦是抑制剂，比如与核酸聚集在一起的腐殖酸和棕黄酸碳水化合物衍生物，以及蛋白酶、去垢剂等。他的解决办法是：尽量提纯DNA，利用spike-in对照突出抑制。
纽约Trudeau研究所分子生物中心设备主任Pamela Scott Adams说，“如果你运行一条标准曲线（并且）得到100％的有效性，那么斜率是－3.3，”如果斜率提示大于100％有效性，那么说明实验中出现抑制。
“有许多好的商业化试管排除了抑制剂，”Willey说，“当我们分析人类组织时，我们传统方法是用（phenol-based）TRI试剂提取，并放入试管（比如，Qiagen的）。我们发现PAX试管对于血液样本不错。”由爱荷华州立大学Jack Gallup研制的PREQXCEL，也是一个优秀的系统，适合于设计缩小抑制现象的反应步骤。（生物通记者 小粥）
