新抗原研究的最新进展加速了肿瘤免疫疗法的发展，包括过继细胞疗法(ACTs)、肿瘤疫苗和基于抗体的疗法，特别是对实体瘤的疗法。随着下一代测序和生物信息学技术的发展，肿瘤特异性抗原(TSAs)的快速鉴定和预测成为可能。与肿瘤相关抗原(TAAs)相比，高免疫原性TSA为个体化肿瘤免疫治疗提供了新的靶点，可作为预测肿瘤患者生存、预后和免疫检查点阻断反应的前瞻性指标。这里总结了基于新抗原的TCR-T免疫治疗策略的鉴定和表征以及临床应用，以及研究现状、存在的问题和临床转化潜力。

肿瘤细胞的MHC分子可表达TSAs或TAAs。TSAs在恶性肿瘤细胞中异常表达或仅在特定的分化阶段产生，其在正常组织中的产生极其有限。TAAs主要是指存在于正常细胞或肿瘤细胞上的抗原分子，但它们并不是肿瘤细胞所特有的，正常细胞可以少量合成，通常在肿瘤细胞增殖时高表达(图1)。这些肿瘤特异性多肽-MHC(pMHC)复合体可被T细胞识别，并在患者体内触发抗肿瘤免疫反应。与其他类型的肿瘤抗原，如肿瘤-睾丸抗原(CTA)和TAA相比，高度免疫原性和肿瘤特异性的TSA为个体化肿瘤免疫治疗提供了新靶点，可作为预测肿瘤患者生存、预后和免疫检查点阻断反应的前瞻性指标。TSA研究的最新进展加速了肿瘤免疫疗法的开发和临床试验，包括ACT、肿瘤疫苗和基于抗体的疗法。下一代测序和生物信息学的进步使TSA的快速识别、预测和临床应用成为可能。

图1 TSA和TAA的特点。

各种临床研究已经评估了针对TAA的免疫疗法的有效性，例如针对ERBB2、MUC1和hTERT的疫苗。癌症患者中TAA的流行使它们成为快速免疫的靶标。由于TAA是非突变的自身抗原，中枢T细胞耐受可能是临床试验中观察到的T细胞反应差的原因之一。然而，肿瘤免疫治疗可以逆转免疫逃逸机制，包括使用肿瘤疫苗改善抗原呈递，通过TIL和TCR转导的T细胞过继转移增加抗肿瘤T细胞，通过免疫检查点阻断(ICBs)恢复CD8+T细胞效应能力，以及由双特异性抗体(bsAbs)和CARs诱导T细胞以增加肿瘤的免疫识别。然而，由于缺乏针对各种癌症的抗原，肿瘤免疫疗法的广泛应用受到了阻碍。在非病毒相关的恶性肿瘤中，TSA可以来自独特的蛋白质或多肽，这些蛋白质或多肽是由异常的RNA剪接和破坏的翻译后蛋白质修饰产生的。对于病毒相关的癌症，如HPV阳性的宫颈癌和EBV相关的鼻咽癌，也可以通过病毒编码的ORF产生TSA。这种避免T细胞耐受的能力增加了TSA特异性T细胞库，因此具有增强肿瘤特异性免疫反应的潜力。此外，免疫治疗增强了对TSA特异性T细胞反应的耐受性，治疗后的免疫记忆为预防疾病复发提供了长期保护。

一、肿瘤特异性抗原(TSAs)的来源

TSA是由于基因组、转录组和蛋白质组的变化而产生的。它们是外来蛋白，在正常组织中不存在，但可以通过各种机制从肿瘤细胞中产生，例如基因组突变、异常转录突变、翻译后修饰(PTM)突变和病毒编码的开放阅读框(ORF)突变(图2a,b,c；表1)。

图2 新抗原预测的计算流程。

表1 各种新抗原及相关癌症的优缺点

二、TSA的鉴定、预测和验证

现在，使用全外显子组测序(WES)、RNA-seq和来自TCGA的蛋白质组数据的融合，可以对整个癌症谱系的TSA进行彻底筛查。基于NGS数据，创建了虚拟肽库，并通过虚拟方法鉴定了潜在的TSA。TSA预测的典型工作流程可总结为以下步骤：突变鉴定、HLA分型、基于HLA结合亲和力的新抗原的筛选和优先排序，以及基于T细胞分析的免疫原性新抗原的实验验证(图2d,e,f,g,h,i)。

( 一)、体细胞突变的鉴定

目前，初始阶段包括使用肿瘤和正常组织DNA的WES来绘制肿瘤特异性遗传异常图，以从NGS数据中检测可能的新抗原。通过比较同一患者肿瘤和正常组织的NGS数据以确定基因变化，免疫基因组学策略的发展大大加快了其预测体细胞突变引起的突变多肽的能力。WES是新抗原预测的NGS数据的推荐来源，因为它通过关注基因组的蛋白质编码区提供了最高的突变复盖率。RNA-seq数据可以与WES相结合来确定突变基因是否在肿瘤中表达。还可以在RNA-seq中找到其他生物信息，例如关于拷贝数变化、微生物污染、转座元件、细胞类型和新抗原存在的信息。质谱学可以高通量鉴定MHC结合肽，并从免疫沉淀和提取中直接检测MHC结合肽。通过比较样品和合成肽的串联质谱图，可以验证免疫基因组学方法预测的新抗原。特别是对于罕见的HLA同种异型和HLA-II配体，绘制肿瘤的HLA配体图可以帮助在临床试验中识别新抗原特异性的癌症免疫治疗靶点。MS与NGS相结合，进一步检测由体细胞突变、非编码RNA和蛋白酶体剪接产生的肿瘤特异性新抗原，这些都是基于全外显子组或转录组的新抗原测序技术所省略的。计算分析包括数据预处理和质量控制，鉴定体细胞突变的变异，以及使用公共基因组、转录组和蛋白质组数据库预测改变的蛋白质和功能效应。新抗原的免疫原性，包括突变多肽和正常多肽的等级亲和力、突变等位基因的频率和基因表达量，基于综合评分系统的过滤技术和新肽特征的定量评分来评估，以实验评估多肽的免疫原性(图2a,b,c；表1)。

( 二)、HLA分型

人类有24000多个不同的HLA-I(HLA-A、B和C)和HLA-II(HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP)等位基因，它们的混合导致了生物多样性。与其他抗原类似，新抗原通常由CD4+T细胞的MHC-II分子和CD8+T细胞的MHC-I分子以细胞特异性的方式递送。患者的HLA等位基因决定了他们的肿瘤特异性抗原库，T细胞可以使用这个抗原库进行识别。因此，预测新抗原最重要的初始步骤之一是确定患者的HLA基因型。大多数方法依赖于从WES或WGS获得的DNA衍生的NGS数据来实现这一目的。例如，Optiype和Polysolver是识别HLA-I类等位基因的优秀工具。其他类型，如HISAT-Genotype、ATHLATES、HLA-HD、HLA-Reporter、PHLAT、HLA-Scan和HLA-Profiler，也可用于HLA-I和HLA-II的分型(图2d)。

( 三)、HLA结合和新抗原呈递的预测

MHC分子加工和呈递的新抗原，已经创建了许多在线预测工具，包括NetChop、NetCTL和NetCTLpan。通过将HLA配体集合数据结合到计算机学习算法中，如线性回归和人工神经网络，可以积极提高其预测能力。使用体外多肽-HLA结合数据集来训练计算机学习模型，NetMHCpan和MHCflurry是当前HLA配体识别系的主要组成部分。它们通过整合来自结合亲和力数据和MS多肽集数据的信息来为MHC-I生成“泛特异性”计算机学习策略，从而改进了肿瘤新抗原的预测性能。利用人工神经网络开发了一系列用于预测MHC-II结合表位的计算技术，包括NetMHCII、NetMHCIIpan、SYFPEITHI、RNAKPEP、MULTIPRED2、ProPred和MHCPred。然而，目前对MHC-II多肽结合亲和力的计算预测不如对MHC-I分子的预测准确。首先，与MHC-I分子相比，MHC-II结合肽在肽长度和结合序列基序方面更加混杂。其次，MHC-II分子中α和β链的多态性也极大地扩展了多肽结合特异性的多样性。鉴于多个过程控制新抗原提呈，可以推断，仅增加结合亲和力并不能准确地反映细胞治疗和T细胞反应。其他特性，包括蛋白酶体切割、肽向内质网的转运、HLA等位基因、多肽与MHC分子之间的结合亲和力等，优先选择可能的新抗原(图2e,f,g)。

( 四)、评估和验证候选新抗原的免疫原性

众所周知，合适的MHC分子提呈和有效的TCR识别是获得免疫原性新抗原的先决条件。通过MHC分子呈递预测的大多数新抗原不会引发免疫反应。因此，在评估潜在新抗原的免疫原性时，考虑pMHC复合物的TCR识别是至关重要的。有许多预测新抗原特异性T细胞识别的程序，最常见的方法是NetCTL和NetCTLspan。根据MHC结合、C末端切割亲和力和TAP转运蛋白生成综合评分，而不是直接预测T细胞连接。最近的研究使用计算机学习或深度学习技术来预测TCR-肽/-pMHC结合。除了识别TCR-pMHC对，pMTnet和GLIPH等聚类方法还可以对识别相同表位的TCR进行聚类，并预测它们的HLA限制。由于TCR对pMHC配体的亲和力较低，预测TCR的结合亲和力仍然具有挑战性(图2h)。使用各种筛选方法评估候选新抗原的免疫原性对于更准确地鉴定和选择适合临床干预的新抗原至关重要(表2)。为了更准确地评估新抗原在免疫治疗中的潜力，对其T细胞反应性的实验验证是至关重要的。新抗原反应性T细胞已经通过基于T细胞的分析、多色标记的MHC四聚体和酶联免疫吸附斑点分析(ELISPOT)来验证或筛选。

表2 用于检测新抗原识别的免疫筛选试验

新抗原肽免疫原性的验证

用于人源化小鼠身上移植PDTX(患者来源肿瘤异种移植)的标本直接来自人肿瘤组织，未经体外培养，稳定地保留了肿瘤的遗传、组织学和表型特征，即肿瘤的异质性。因此，PDTX可用于筛选MHC四聚体对免疫细胞的敏感性或耐药性，检测结果具有良好的临床预测性。此外，由于PDTX在移植过程中更好地保留了肿瘤间充质和干细胞成分，因此肿瘤生长的微环境更接近实际情况。PDTX还可以为肿瘤标本的保存和传代提供大量标本，可用于临床治疗前对细胞或疫苗制剂免疫原性的有效性验证。它还可用于确定小型临床前试验的适当样本量和疗效评估。PDTX试验可以提前预测和验证新抗原的疗效，提高了肿瘤新抗原个体化治疗的有效性。

ELISPOT对免疫原性的体外验证

T细胞免疫原性试验是评价候选新抗原免疫原性的最直接方法。用流式细胞仪检测T细胞活化标志物4-1BB和OX-40在多肽刺激下的反应性，用ELISPOT法检测IFN-γ的产生。在生物体中，细胞在受到刺激后会产生细胞因子(如IFN-γ)。这些细胞因子将被特定的抗体捕获，然后形成颜色斑点。斑点的数量代表相应新抗原的免疫原性水平。这一平台将进一步提高YuceNeo新抗原筛查的准确性。ELISPOT对细胞的生物学过程影响不大，在细胞检测中具有较高的灵敏度。基于单细胞水平的检测，通过ELISPOT可以检测到200000-300000个细胞中的一个IFN-γ分泌细胞。ELISPOT法比ELISA法和极限稀释法更敏感。

NEST对免疫原性的体外验证

此外，scRNA-seq用于在与串联微基因(TMG)转染或多肽刺激的抗原提呈细胞(APC)共培养的TIL中发现与高水平IFN-γ表达的细胞相关的TCR序列。ELISPOT可以在体外用来分析哪些新抗原可以刺激T细胞分泌细胞因子，但它不能检测肿瘤特异性T细胞的TCR。YuceNeo独特的NEST(特定T细胞新抗原扩增)验证技术将多肽刺激的T细胞培养的TCR测序与生物信息平台相结合，以识别抗原特定的克隆扩增。YuceNeo的NEST平台比较了有和没有新抗原肽刺激的TCR数据库。如果能发现频率增加的TCR，则表明相应的新抗原具有免疫原性。NEST技术平台不仅可以高通量验证TruNeo™筛选的新抗原的免疫原性，还可以用于动态监测肿瘤免疫治疗的效果。基于WES引导的新抗原预测和多肽刺激的T细胞培养的TCR测序，TCRVβ的新抗原特异性克隆通过突变相关的新抗原特异性T细胞功能扩增(MANAFEST)试验进行了敏感的鉴定。除了评估TCRVβ克隆的肿瘤特异性外，还可以研究新抗原特异性T细胞反应随时间的动态变化，并可以使用治疗前后的液体活检来监测免疫治疗的效果(图2i)。

三、肿瘤抗原特异性T细胞的富集和分离

胸腺发育过程中TCR的V(D)J重组导致人T细胞库中TCR序列的巨大多样性。据估计，在普通成年人中，大约有4×10^11个总循环T细胞和大约10^10个独特的T细胞克隆。因此，T细胞克隆对绝大多数非病毒抗原是特异的。在目前的技术条件下，外周血中克隆的频率远远低于分离抗原特异性TCRs的频率。因此，TCR分离工作通常始于允许富集具有所需抗原特异性的T细胞的方法(图2i)。

( 一)、抗原特异性T细胞的富集

TILs的扩增

在某些类型的实体瘤中通常存在大量的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。与外周血T细胞相比，肿瘤组织中的T细胞通常富含肿瘤抗原特异性克隆。一些研究小组已经使用扩增的TIL作为寻找肿瘤特异性TCR的来源。此外，TIL体外扩增本身就是一种对几种实体瘤有效的过继T细胞疗法。研究表明，Iovance名为Lifileucel的TIL疗法在临床试验中具有很强的疗效。

接种疫苗

针对感兴趣抗原的T细胞可以通过接种策略在体内选择性地扩增。一种常见的方法是用感兴趣的抗原接种人HLA转基因小鼠，这可以从淋巴结和脾脏中提取抗原特异性T细胞。在某些情况下，参与肿瘤疫苗试验的患者的外周血被用作TCR富含抗原的T细胞的来源。

外周血T细胞的选择性体外扩增

外周血T细胞在体外以抗原特异性的方式被刺激，以驱动具有所需特异性的选择性T细胞扩增。这一领域的早期开创性工作包括体外刺激外周血T细胞以优先扩增病毒特异性T细胞。这些刺激方法已被用于扩增富含TAA和新抗原特异性的T细胞。这些方法通常通过自身抗原提呈细胞(APC)，通常是DC细胞，以外源多肽的形式或通过用目的抗原脉冲的cDNA/RNA递送来刺激T细胞。多项研究表明，在患者外周血中，最初选择PD-1+和/或抗原性经验(CD45RO+CD62L+、CD45RO+CD62L-或CD45RO-CD62L-)T细胞可以进一步增强肿瘤特异性T细胞的体外富集。为了克服产生用于抗原刺激的自体成熟DCs的需要，已开发出所谓的人工抗原提呈细胞(aAPC)。例如，一种常见的aAPC系统是使用髓系白血病细胞系K562，该细胞系HLA-A、B和DR阴性，该细胞系通过提供各种HLA等位基因和共刺激分子的稳定转导而起到模块化aAPC的作用。其他无细胞aAPC系统也被开发出来将HLA和共刺激分子偶联到珠子和纳米颗粒上，以刺激外周血T细胞，并获得大量临床需要的抗原特异性T细胞。

( 二)、抗原特异性T细胞的分离

在获得富含靶向特异性T细胞的多克隆T细胞产品后，有必要从大量的T细胞中分离抗原特异性T细胞。这一领域的方法通常包括用感兴趣的同源抗原刺激T细胞，并基于已知的与T细胞激活相关的分子表达增加来分离抗原反应性T细胞。例如，CD8+T和CD4+T细胞中的4-1BB和OX40允许通过FACS分选或磁珠分选来分离这些细胞。另一种方法是，使用肽-HLA聚合物MHC染色，然后进行FACS分选或磁珠分选，是鉴定和分离抗原特异性T细胞的有效方法。尽管HLA聚合物库正在扩大，但这些试剂仍然局限于相对常见的HLA等位基因。另一种方法是IFN-γ捕获，IFN-γ由抗原刺激的CD8+T细胞和CD4+Th1细胞快速分泌，因此，IFN-γ捕获基于IFN-γ的产生来识别和捕获抗原刺激的T细胞。

四、TCR表位发现策略：从TCR到表位

( 一)、基于计算机算法的预测策略

在预测抗原表位时，应考虑到HLA的结合亲和力和免疫原性。抗原肽可以通过MHC表位预测算法来确定候选抗原的优先顺序。基于结构(SB)、基序矩阵(MM)、定量亲和力矩阵(QAM)、人工神经网络(ANN)、支持向量机(SVM)等相关方法开发了相应的预测软件。预测算法包括NetMHC-4.0、免疫表位数据库(IEDB)、NetMHCpan4.1、NetMHCIIpan4.0、SYFPEITHI和HLAthena，用于计算和预测TCR表位。

( 二)、基于肿瘤细胞的筛选策略

采用免疫沉淀法获得HLA多肽，产物经酸洗脱得到多肽，然后用质谱仪进行鉴定。用一次质谱法测定多肽片段的质量，选择丰度较高的多肽进行二次质谱分析。在二次质谱中，多肽相互碰撞，导致氨基酸键断裂，通过检测器分析多肽碎片离子，获得筛选的多肽片段的氨基酸序列信息。技术路线相对成熟，低丰度表位难以鉴定。

( 三)、基于T细胞的筛选策略

T-Scan

这种高通量、集中筛选和识别全基因组T淋巴靶抗原的新方法，可以用来识别T细胞能有效识别的抗原。将人全基因组靶抗原库导入含有颗粒酶报告系统的靶细胞，与表达TCR的T细胞共孵育后，可对TCR的靶抗原进行富集和鉴定。T-Scan可用于识别CD8+T细胞的功能性靶抗原，并可从大量记忆T细胞中重复检测靶抗原。它们具有在全基因组范围内识别靶抗原、基于T细胞的功能测试以及鉴定潜在的脱靶抗原的优点。

Cellular系统

将靶抗原库导入含有Trogocytosis报告系统的靶细胞，并与表达TCR的T细胞共同孵育后，TCR的靶抗原可以被富集和鉴定。咬合是高度特异的，仅发生在成功识别TCR抗原的细胞之间。将表达已知配对的TCR-Jurkat T细胞按1/10000的比例注射到APC细胞和细胞识别的特定pMHC分子的混合物中。通过流式细胞术，咬合仍然能够准确地标记与该TCR特异性配对的超过70%的APC细胞，而其他未被识别的抗原提呈细胞则不能。该策略还具有在全基因组范围内识别靶抗原、基于T细胞的功能测试以及鉴定潜在的脱靶抗原的优势。

SABAs系统

将靶抗原库导入含有TCR-pMHC双功能分子报告系统的靶细胞，与表达TCR的T细胞共同孵育后，可对TCR的靶抗原进行富集和鉴定。优势包括靶抗原的全基因组鉴定，基于T细胞的功能测试，以及鉴定潜在的脱靶抗原。

Presenter系统

将表达抗原库的靶细胞与表达TCR的T细胞共孵育后，对大量杀伤的靶细胞进行高通量测序，以确定TCR的靶抗原。

RootPath系统

通过单细胞测序找到TCR序列后，合成量化的TCR。与表达Mini基因的靶细胞共培养后，T细胞报告系统确认肿瘤反应性TCR。携带这种TCR的T细胞随后被评估，以确定它们是否能够识别肿瘤并与其发生反应。该系统具有量化TCR合成和T细胞功能测试的优点。

MHTEM系统

将多个HLA和靶抗原Mini基因的文库导入靶细胞。与T细胞共培养后，通过高通量测序鉴定大量被杀死的靶细胞，以鉴定该TCR的靶抗原。该系统的优点是基于T细胞功能测试，同时筛选多个HLA提呈表位，并鉴定潜在的脱靶抗原。

( 四)、基于酵母展示的策略

将外源目的蛋白基因序列(外源蛋白)与特异性载体基因序列融合，导入酵母细胞。利用酵母细胞内蛋白运输机制(GPI锚定)表达目的蛋白，并将其定位于酵母细胞表面。酵母用来展示随机氨基酸表位，TCR蛋白的表达用来富集潜在的抗原表位；该系统也被称为3T系统。

五、TCR克隆策略：从已知表位到特异性TCR

TCRs的特异性由两个独立基因TCRα和TCRβ的区域编码决定，在从T细胞群体中确定功能TCR序列方面提出了独特的挑战。TCR的准确分选是设计TCR-T细胞疗法用于后续治疗的关键(图3)。

图3 用于个性化工程TCR-T细胞治疗的新抗原特异性TCR的快速鉴定。

肿瘤(T)和正常(N)DNA被用来进行WES和RNA-seq来鉴定肿瘤特异性的非同义突变。候选新抗原用于设计编码突变多肽的串联微基因(TMG)和合成突变肽文库(Step1)。TIL和PBMC是从患者样本的单细胞悬液中分离出来的。使用单细胞TCR-CITE-seq分析TIL和PBMC，并使用基因和表面蛋白表达的组合标签来预测候选的新抗原反应性T细胞(Step2)。将候选抗原反应性T细胞与表达候选新抗原(TMG或多肽)的自体APC共培养，并扩增抗原特异性T细胞(Step3)。通过流式细胞术分选抗原特异性T细胞，并通过scTCR-CITE-seq或深度测序鉴定和筛选新抗原反应性TCR。然后，用单细胞多重嵌套式RT-PCR方法反转录TCRα/β链，并构建其相关的质粒(Step4)。通过将所选定的TCR序列克隆到逆转录病毒载体中并转导T细胞来产生表达候选反应性TCR的T细胞。不同的筛选实验证实了TCRα/β链转导的T细胞对新抗原的识别(Step5)。从患者身上获得PBMC，并通过上述方法扩增新抗原特异性TCRα/β链的反应性T细胞(Step6)。经过验证的新抗原反应性TCRα/β链被选择来设计最终的个性化TCR-T细胞产品，该产品将被注射到患者体内进行细胞治疗(Step7)。

( 一)、基于四聚体染色的策略

多细胞TCR克隆

选择特异性抗原四聚体染色的多个细胞，扩增这些阳性细胞的TCR序列。该方法技术难度不大，扩增成功率高。然而，需要大量的交叉配对实验来验证TCR链的配对性和特异性，可能会遗漏重要的TCR链。

单细胞TCR克隆

选择特异性抗原四聚体染色的单个细胞，扩增TCR序列。一些研究已经通过进行单细胞RT‒PCR扩增了TCR-α和-β链，从而避免了在抗原特异性T细胞分离后扩增T细胞克隆的需要。在该方法中，用FACS将单个T细胞分选到含有RT-PCR缓冲液的孔中，从单个细胞中进行RT-PCR，然后用PCR法扩增TCR-α和-β链。这种方法减少了扩增单个T细胞克隆所需的时间和劳动力；然而，这种方法的缺点是，在测序之前无法对T细胞克隆进行确证分析来评估抗原特异性。单细胞RNA测序(scRNAseq)也已经成为发现TCR的独特而有效的平台，它允许单细胞评估细胞基因表达和基因转录。该方法包括用感兴趣的抗原刺激T细胞，然后进行scRNAseq测序分析。抗原特异性T细胞由IFN-γ、TNF-α和/或IL2等效应细胞因子识别。然后从同一数据集获得激活细胞的TCR-α和-β链的转录本。该方法具有成本低、速度快、特异性高等优点，可直接实现TCR配对，但涉及的技术比较复杂。

Feature barcoding技术

用单细胞液滴法制备四聚体染色细胞，构建细胞膜DNA标签、RNA表达和TCR-V(D)J文库并测序。采用10×特征条码技术，通过磁珠富集含细胞表面蛋白和抗原-MHC复合体的标签序列，构建文库。然后，将相对较长的部分用于构建mRNA文库。通过嵌套PCR对V(D)J区进行富集，构建V(D)J文库。该方法可同时克隆多个表位的特异性TCR。然而，缺点包括可分析的细胞通量有限，需要大量的TCR合成，T细胞来源有限，成本高和周期长。

HLA-肽-cDNA标签复合体技术

使用DNA标签标记具有多个特异性的表位，并使用四聚体同时染色多个表位特异性T细胞。这种方法可以同时克隆多个抗原表位的特异性TCR，但难度大，非特异性反应存在问题。

( 二)、基于T细胞功能分析的策略

单细胞RNA+VDJ测序

对抗原刺激的T细胞进行单细胞RNA+VDJ测序，测序采用10×RNA表达+TCR VDJ测序，不依赖四聚体。然而，非特异性增加了后续的工作量、成本和周期时间。需要正常的T细胞活性，活性较差的TIL是不合适的。

激活的marker分选

激活分子(PD1，4-1BB)用于分选抗原激活的T细胞，而不依赖于四聚体。这种方法依赖于正常的T细胞活性，不适用于活性较低的TIL。

细胞内因子分选

T细胞在抗原刺激后被细胞内因子染色，不依赖四聚体。这项技术依赖于正常的T细胞活性，活性较差的TIL不适用。操作复杂，技术困难。

Lightning光流控系统

Berkeley Lights的Lightning光流控平台使研究人员能够通过在整个数据收集过程中记录细胞的视频，在指定的时间范围内精确研究单个细胞的行为。该平台通过邮票大小的硅芯片的微流体工作，其中包含微小的纳米开口和用于分离和生长单个细胞的细长而狭窄的腔室。这个系统可以用来获得无与伦比的生物学洞察力。Lightning的新光流控技术可以在一个平台上分离和鉴定1000个单细胞。传统上，单细胞分析需要在几个月的时间内使用多种仪器。Lightning系统允许细胞克隆和生长，并在几天内进行分析和恢复。在自动克隆后，使用明场和荧光技术对细胞进行单独检测和监测。这可以在每个实验中创建每个细胞的可视记录，并在任何其他方法无法实现的水平上理解这种复杂的生物学。在与免疫基因组学相关的研究中，该系统可用于分析后选择性地获得靶T细胞/单个T细胞克隆，并对其进行评估，用于后续的下游测序和其他实验。单细胞水平的研究和快速高效地构建CAR/TCR载体加速了T细胞基因修饰的进程。

液滴捕获微流控(DRRM)细胞系统

该系统是基于液滴微流控技术开发的超高通量单细胞分选平台。通过使用最新的微流控技术，每秒可以形成数千个微滴。细胞被包裹在微滴中，可以经历生长、分裂、代谢和反应等生化过程。当细胞与液滴中的荧光筛充分结合时，会产生不同强度的荧光信号。利用微滴分离技术通过荧光信号对低产率和高产率的细胞进行分离，以实现分离过程的高通定量。用微流控系统检测和分析活化的T细胞，并克隆TCR。这项技术基于T细胞功能分析，减少了非特异性发现。然而，每次分析的T细胞数量有限，系统复杂性高。

( 三)、高通量文库策略

高通量的人类来源的TCR文库从大量患者来源的TIL中产生单细胞液滴。在液滴中扩增出TCR-α和-β，TCR-α和-β链串联融合。将TCR在载体中串联表达，形成TCR质粒和病毒库，构建人TCR文库。在T细胞报告系统和特异性抗原表位的刺激下，高通量筛选特异性TCR，直接从TCR文库克隆抗原表位。这种方法是基于发现TCR的T细胞功能，特异性好；该方法允许选择TCR的特定亲和力区间。构建的文库资源可以再生，并逐渐消除对资源的依赖，但技术难度较高。

六、基于特异性TCRs的TCR-T细胞

过继T细胞治疗(ACT)使用患者自身天然存在的或基因工程的抗肿瘤淋巴细胞，因此具有高免疫原性的新抗原为ACT治疗提供了极好的靶点。目前，不同的ACT技术正在开发中，包括TIL、CAR-T和TCR-T，它们已成功地用于治疗各种恶性肿瘤。然而，TIL和CAR-T细胞治疗实体瘤的临床疗效并不理想，因为存在许多障碍，包括可用抗原稀缺、肿瘤异质性或肿瘤免疫抑制。晚期实体瘤的特征还包括结缔组织增生和异常血管生成，导致缺氧和营养供应改变，这两种情况都会导致较差的临床结果。TCR-T细胞疗法是一种具有几个优点的替代疗法。首先，TCR-T细胞的靶抗原库比CAR-T细胞的靶抗原库大。其次，TCR-T细胞诱导激活所需的表位密度低于经典CAR-T细胞的表位密度(1-50 vs 10^3个表位/细胞)。这种提高的敏感性可能会改善肿瘤细胞的检测和杀伤力。最后，TCR-T细胞的高亲和力也可能增强其疗效。TCR-T细胞与靶细胞的亲和力低于CAR-T细胞。有可能允许每个TCR-T细胞“扫描”并清除几个抗原提呈肿瘤细胞(图3)。

( 一)、TCR-T细胞的定义

TCR是一种表达在T细胞表面的受体，能特异性识别肿瘤细胞表面表达的相关抗原，并由MHC递呈，从而介导抗肿瘤作用。在肿瘤患者中，存在肿瘤反应性T细胞。然而，这些天然抗肿瘤细胞来源有限、分离困难、体外难以大规模扩增，不能用于临床治疗。为了克服这些困难，可以从肿瘤反应性T细胞中分离TCR编码基因，将其导入普通T细胞，并注入肿瘤特异性杀伤能力。通过这种方式，可以快速产生大量的抗原特异性T细胞，以满足应用需求。这些表达外源TCR并识别特定表位的T细胞称为TCR-T细胞。与CAR-T细胞的主要区别在于，只有TCR序列(α和β链)被引入TCR-T细胞。TCR信号转导依赖于宿主的T细胞信号通路。除了含有特异性抗原的单链可变区(scFv)序列外，CAR分子序列还含有共刺激信号分子(CD28和/或4-1BB)的功能基序。TCR转导的T细胞可以靶向任何表面或细胞内的抗原。几项临床试验已经证明，为设计特异性TCR-T细胞而鉴定新抗原的有效方法是可行的。当新抗原被识别和预测时，新的表位特异性T细胞被分离出来，并对它们的TCR进行测序。具有已知新抗原反应性的候选TCR序列可以通过转座子或CRISPR/Cas9系统导入T细胞。将这些表达新抗原特异性TCR(TCR-T)的工程细胞注射到患者体内，验证其肿瘤活性后，确定其抗肿瘤作用。

( 二)、TCR-T细胞治疗靶抗原的选择

TCR-T细胞通过抗原处理后对pMHC/肽的识别来识别肿瘤细胞。因此，抗原特异性决定了TCR-T细胞杀伤的准确性。理想的肿瘤抗原应该选择性地在肿瘤组织中表达，而在正常组织中不表达，以避免引起自身免疫反应。同时，靶抗原应具有免疫原性，以诱导有效的抗肿瘤免疫反应。TSA是TCR-T细胞的理想靶抗原。TSA主要是基因突变的产物。这种类型的抗原只存在于肿瘤细胞中，而在正常细胞和组织中不表达。理论上，TSA是TCR-T细胞治疗的理想靶点。TSA的肿瘤特异性意味着不存在自身免疫耐受，对TSA的免疫反应不会损害正常组织。然而，在TCR靶向TSA的研究中还存在一些问题。一方面，基因突变产生的抗原肽免疫原性较弱，难以分离出高亲和力的TCRs。另一方面，TSA通常是针对单个肿瘤的，甚至只出现在特定的时间点。以这种抗原为靶点需要非常个性化的TCR-T细胞制备过程。目前，有必要积极寻找免疫原性强的肿瘤特异性新抗原，开展TCR-T细胞的个体化临床治疗。

( 三)、TCR-T细胞的抗原提呈

TCR-T细胞识别靶细胞的先决条件是靶细胞表面存在抗原表位，这涉及到抗原提呈。根据抗原的来源、加工方法和MHC，抗原的加工和提呈可分别在胞浆和溶酶体中完成。内源性抗原的处理和递呈过程如下：蛋白质分子的内源性合成包括内源性抗原，内源性抗原也是TCR-T细胞治疗肿瘤的主要靶点。内源性抗原在细胞内的降解过程与普通蛋白质的降解过程没有根本的不同。事实上，内源性抗原在细胞质中的降解利用了正常的细胞内蛋白质转换的降解机制。内源性抗原被胞浆中的蛋白酶降解为5~15个氨基酸的多肽，经胞浆途径加工和提呈，并受MHC-I分子的限制。外源抗原在内体溶酶体中被降解，产生多肽，其中一些长度为13-18个氨基酸甚至0个氨基酸，并能与适当的MHC-II分子结合。抗原是通过溶酶体途径处理和递送的，并依赖于MHC-II递送到细胞表面。DC细胞和巨噬细胞是参与非经典途径的主要APC。只有能被提呈的抗原才可能被T细胞识别。不同个体间存在MHC差异。输入细胞和受体之间的MHC不匹配会导致免疫排斥。因此，TCR-T细胞主要是在体细胞修饰后输注。在一定程度上，TCR-T细胞治疗的应用受到限制。T细胞主要通过TCRs识别特定的pMHC识别靶细胞。TCR基因重排可以导致大约10^18个TCR序列，这使得识别和分离特定的TCR序列变得困难。然而，由于多肽与MHC结合的严格构象要求，相同的TCR可以在不同的个体中识别相同的pMHC，这也为TCRs的普遍性奠定了基础。因此，T细胞的记忆反应同时受到抗原特异性和MHC等位基因特异性的制约。

( 四)、TCR-T细胞的治疗过程

TCR识别pMHC/肽以介导T细胞对肿瘤的识别和杀伤。通过分离对肿瘤抗原有反应的TCRα和β链，并将它们以病毒或非病毒介导的方式转移到T细胞中，可以快速产生大量的抗原特异性T细胞。特异性抗原反应性TCR序列可被分离、储存和以质粒形式扩增，并可在需要时立即使用。这使得TCR-T细胞的临床应用门槛大大降低。TCR基因可以作为现成的试剂用于治疗表达特定抗原和MHC限制性分子的肿瘤患者。因此，肿瘤患者TCR-T细胞治疗的一般过程：①从患者外周血中提取T细胞，分离T细胞；②通过添加CD3/CD28磁珠和IL-2激活T细胞；③通过病毒或其他方式将TCR基因转入活化的T细胞；④将TCR转导的T细胞(TCR-T细胞)进一步培养并扩增到合适的数量；⑤在输注TCR-T细胞之前，患者进行适度的化疗或放疗，以清除体内的淋巴细胞，增强TCR-T细胞的治疗效果；⑥患者静脉注射足够数量的TCR-T细胞；⑦患者输注后密切观察临床疗效及相关不良反应。

( 五)、TCR-T细胞治疗的毒性评价及疗效监测

与TCR-T细胞相关的毒性评估包括生物信息学、转录和蛋白质组数据库的免疫学分析，以及评估TCR-T细胞识别正常细胞或组织的能力的体外测试。off-target毒性或交叉反应与TCR识别正常细胞上不同于靶向的抗原有关。因此，有必要包括一种在临床前水平评估TCR交叉反应的策略，特别是当TCR序列已被修改以提高亲和力时。可靠的免疫监测对于评估基于新抗原的免疫疗法是否可以达到预期的免疫效果以及扩大有效的免疫候选名单以包括更大和合适的患者亚群至关重要。预测off-target和off-tumor毒性(在正常组织中存在交叉反应表位)的方法包括：在计算机预测中，包括基序BLAST和HLA结合预测和表达、pMHC界面的结构建模，以及TCR聚类。实验评估包括以下方法：丙氨酸/甘氨酸扫描、组合肽库(X-扫描)和条形码肽库、对原代健康细胞的体外细胞毒性测试、基于TCR的组织学分析。肿瘤反应性T细胞反应对包括肿瘤疫苗、ACTs、bsAbs和ICBs在内的各种治疗方法的抗肿瘤效果至关重要。为了预测癌症免疫治疗的效果，可以测量和跟踪肿瘤反应性T细胞的数量和质量。CD39、PD-1、TIM-3、OX40、4-1BB、IFN-γ、TNF-α等多种有效标记物可用于检测输注产品中新抗原反应性T细胞的比例及其识别自体肿瘤的能力。CCR5和CXCL13也可以作为CPI敏感性的T细胞内在指标。值得注意的是，循环肿瘤DNA(ctDNA/cfDNA)水平作为肿瘤负荷的替代指标，可用于动态检测产生新抗原的突变。新抗原特异性TCR克隆类型的特征表征了肿瘤中TIL的特征，使得在新抗原特异性癌症免疫治疗中仅基于TIL转录状态来预测TCR。这些特征可以提供一定程度的克隆能力。预测各种免疫疗法的临床反应可以通过识别血液中的抗癌TCR来实现，更关键的是，不需要对肿瘤中假定的新抗原进行功能性筛选。

( 六)、增强TCR-T细胞治疗的持久性和抗肿瘤功能

T细胞的持久性是持续免疫监测的基本要求。许多临床试验表明，大多数无反应的患者体内输注的肿瘤特异性T细胞没有持久性。相比之下，获得完全缓解或没有复发和肿瘤控制的患者工程T细胞显示出强大的增殖能力和长期持久性。为了维持T细胞的持久性，多种细胞因子被联合使用来支持T细胞的生存和扩增。众所周知，全身注射IL-2可以在保持功能活动的同时扩增T细胞，在一些转移性黑色素瘤和肾癌患者中已经实现了长期的消退，并已得到FDA的批准。这一策略目前用于CAR-T和TCR-T细胞免疫治疗。IL-7是一种造血细胞因子，调节T细胞生物学的许多方面，对T细胞的生存、稳态和增殖至关重要。它通过上调抗凋亡分子Bcl-2的表达来促进幼稚和记忆T细胞的存活。IL-12是有效的抗肿瘤免疫反应的主要贡献者，它通过诱导细胞毒酶如穿孔素和细胞因子来激活T细胞的效应器功能。IL-18是另一种细胞因子，具有与IL-12相同的生物学效应，但毒性较低。探索IL-18替代IL-12的研究表明，旨在分泌IL-18的CAR-T细胞通过产生IFN-γ和其他几种细胞因子，在体外和体内提高CAR-T细胞的存活率和抗肿瘤活性。IL-18刺激人CD4细胞的扩增，并激活免疫良好的小鼠的内源性免疫系统。已知IL-15可刺激干细胞记忆T细胞(Tscm)的产生，具有维持长期T细胞反应的潜力。IL-7和IL-15诱导幼稚前体细胞生成人记忆干细胞。与IL-2不同，IL-15不与IL-2Rα链结合，因此不刺激Treg，可能具有更具选择性的作用。与IL-2相比，IL-15倾向于通过保留CAR-T细胞的Tscm表型来增强其抗肿瘤活性。IL-21是新发现的常见γ链细胞因子家族成员。与IL-12和IL-15相似，IL-21不刺激DC细胞。相反，它通过抑制Foxp3抑制Tregs的扩增，从而有利于抗原特异性CD8+T细胞的富集。IL-21促进CD8+T细胞成熟，增强杀伤活性，促进记忆性CD8+T细胞分化。IL-21在体外促进抗原特异性CD8+CTL的产生，在小鼠模型中的表现远远好于IL-2或IL-15。这些结果表明，细胞因子可以单独使用或与其他细胞因子联合使用，以产生具有记忆表型的肿瘤特异性T细胞。细胞因子增强肿瘤过继免疫治疗的持久性、增殖能力和抗肿瘤作用。

( 七)、TCR-T细胞治疗的影响因素

研究表明，TCR-T细胞在与抗原阳性的肿瘤细胞接触时，可产生大量的炎症因子，如IFN-γ、IL-2、TNF-α等。它们表现出抗原特异性的细胞毒作用，并诱导抗原刺激的反应性增殖。随着分子生物学、基因修饰方法和转导技术的发展，TCR-T细胞的构建体系取得了很大进展，为进一步提高TCR-T细胞的治疗效果奠定了基础。与其他ACT技术一样，TCR-T细胞疗法具有以下优点：①在短时间内产生大量肿瘤抗原特异性T细胞用于治疗；② T细胞可在体外处理和扩增，绕过患者免疫功能障碍的影响，并产生大量的效应细胞；③ T细胞的体外激活和扩增防止了患者应用生物制剂造成的严重副作用；④通过T细胞的体外培养，可以通过加入不同的细胞因子或试剂来分化T细胞，以获得更强大的TCR-T细胞和更持久的杀伤作用。然而，TCR-T细胞与其他细胞一样，其治疗效果也受到多种因素的影响。

输注的细胞数量

TCR-T细胞与肿瘤细胞的比例直接关系到治疗效果。研究表明，效应细胞至少应占T细胞总数的1%-10%。也就是说，要有效控制肿瘤，人体内注射的效应细胞数量应达到(2-20)×10^9。然而，一次输入过多的效应细胞可能会导致严重的脱靶效应，甚至死亡。因此，每次通过重复输注少量细胞，患者体内特异性T细胞的数量可占CD8+T细胞总数的5%。动物实验表明，反复细胞输入有助于维持对肿瘤细胞的持续攻击，并对肿瘤逐渐缩小起到作用。

免疫抑制因子

当效应细胞被输注回体内时，它们不可避免地会受到体内免疫抑制状态的影响。在早期的研究中，提高输注细胞活性的主要方法是同时给予IL-2、IFN-γ等细胞因子。然而，IL-2在增强输注细胞活性的同时，也促进了CD4+CD25+Treg细胞的增殖，这是一类重要的免疫抑制细胞。此外，免疫检查点也被发现是影响免疫细胞治疗的重要因素之一。其中，CTLA-4和PD-1的作用最为显著。根据在CAR-T细胞治疗方面的经验，CTLA-4和/或PD-1阻断抗体如果在TCR-T细胞回输后的正确时间给予患者，可以极大地改善临床结果。除了这些传统的免疫抑制细胞和分子外，一些代谢调节分子也抑制效应T细胞的功能，如CD73和吲哚-2,3-双加氧酶1(IDO1)。在今后的治疗中应考虑肿瘤微环境中的这些免疫抑制因素。

肿瘤异质性

肿瘤异质性是指同一肿瘤组织内不同恶性细胞之间的遗传和生物学差异。在TCR-T细胞治疗中，异质性的影响主要体现在抗原表达和提呈上的差异。肿瘤抗原的表达水平和免疫原性是TCR-T细胞治疗的基础和关键。如果肿瘤细胞不表达或呈递靶抗原，TCR-T细胞就不能攻击这些肿瘤细胞。在TCR-T细胞治疗中，希望靶抗原在大多数(如果不是全部)肿瘤细胞中高度表达，然而，现实情况是，单个靶抗原只在少数几个恶性细胞中表达。这需要使用具有两个或更多靶点的TCR-T细胞进行治疗。此外，还应考虑针对MHC-I类和II类分子限制性抗原的治疗。多靶点联合治疗可能产生更积极的结果。此外，肿瘤特异性抗原的表达往往在T细胞浸润后下调甚至终止。抗原表达的改变与特定肿瘤细胞的清除有关。同时，它还与肿瘤细胞中关键基因的变化有关，如抗原基因、MHC基因以及与抗原处理和提呈相关的基因的表达和修饰。幸运的是，一些TCR-T细胞靶抗原是受表观遗传调控的。去甲基化或组蛋白去乙酰化酶药物可增强此类抗原的表达，改善T细胞的治疗效果。

效应细胞的数量

TCR细胞的分化程度、存活时间、向肿瘤部位转移的能力和表达水平影响细胞治疗的效果。在TCR-T细胞治疗中，T细胞的类型和分化程度直接影响效应细胞的功能和作用时间。这些因素在很大程度上决定了TCR-T细胞治疗的疗效。首先，T细胞被激活，并最终分化为效应细胞(Teff)和记忆细胞(Tm)。一方面，体外研究表明，Teff细胞在短期内更有效地杀伤细胞。另一方面，临床研究表明，Teff在体内的存活时间在很大程度上决定了治疗效果。这意味着Tm细胞在用于治疗时将取得更好的效果。这一影响因素在CD8+T细胞选择中更为明显。当初始抗原和共刺激信号达到一定的质量和数量时，幼稚T细胞(Tn)可以分化为干细胞样记忆T细胞(Tscm)、中枢记忆T细胞(Tcm)、效应记忆T细胞(Tem)和Teff细胞。临床前研究表明，CD8+T细胞的分化和增殖是相反的。因此，可以推断CD8+T细胞的分化程度与其在体内的持久性和治疗效果呈负相关。目前，有两种策略可用于改进T细胞治疗。一种是添加合适的细胞因子，例如，加入IL-7+IL-15或IL-15+IL-21可导致低分化CD8+T细胞的培养。另一种方法包括根据CD62L的表达富集低分化的T细胞；然后这些细胞充当基因转移的受体细胞。通过调整培养方案和适当的基因修饰，可以提高TCR-T细胞中Tm细胞的比例，延长T细胞的存活时间。

此外，注射的T细胞亚群类型也直接影响治疗效果。幼稚T细胞向功能性T细胞的分化受周围环境中各种细胞因子的影响。反过来，分化的T细胞会影响T细胞的功能。这种变异性在辅助性T细胞(Th)分化中尤其常见。CD4+T细胞可分化为多种亚型，包括Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Tfh和Treg细胞。就抗肿瘤作用而言，Th1和Th17是功能最强的细胞亚型。加入CD4+T细胞，尤其是Th1细胞，可阻止CD8+T细胞的耗竭，增加CD8+T细胞的渗透，从而达到有效的杀灭肿瘤的目的。在动物实验中，Th17细胞增强了TCR-T细胞对肿瘤的清除作用，这种作用与其转化为Th1细胞有关。研究通过将MHC-I类分子限制性的TCR和/或CD8分子转移到CD4+T细胞中，有效地激活了Th细胞的活性。有可能通过控制输注的T细胞亚群来提高细胞治疗的疗效。提示CD8+T细胞与Th1/Th17细胞联合应用可提高T细胞的治疗效果。

输注T细胞的亲和力

T细胞亲和力是指T细胞对特定浓度的抗原作出反应的能力。在TCR-T细胞中，转入的TCR通常具有很高的亲和力。因此，TCR-T细胞的亲和力主要与TCR的表达水平有关。通过优化基因转移方法，包括基因转移方法的选择、最佳载体组分的使用和转基因盒的使用，提高TCR转基因的表达。根据CAR-T细胞研究的经验，使用慢病毒载体和EF-1启动子，有可能显著提高TCR的表达水平和比例。此外，通过限制或消除TCR错配可以增强TCR基因的表达。促进转基因TCR α和β链的正确配对(防止和减少TCR错配)的策略主要分为两大类。首先，以小鼠修饰的TCR为代表，即将C区替换为小鼠来源的序列，以防止人转基因TCR与自身TCR的错配。其次，正确的配对是通过CRISPR/Cas9介导的内源性TCR敲除实现的。除了增强TCR的表面表达外，还可以通过改变TCR序列和优化策略来增强TCR的亲和力，以提高治疗效果。研究发现，高亲和力MART-1特异性TCR介导的肿瘤应答率明显好于低亲和力TCR。此外，亲和力增强的NY-ESO-1特异性TCR介导的治疗更有效。此外，还有不同的方法可以提高TCR亲和力，一个典型的例子是通过改变TCR的CDR序列来提高亲和力，通过改变CDR区某些氨基酸的类型可以提高TCR亲和力。虽然增加TCR亲和力可以显著改善T细胞功能，但应特别注意潜在的脱靶效应。在临床试验中，TCR对CEA/HLA-A2、MAGE-A3/HLA-A2和MAGE-A3/HLA-A1的亲和力增强与患者的毒性反应相关。

趋化因子受体和免疫调节受体在输注T细胞中的表达

目前，TCR-T细胞治疗主要通过静脉输注实现。T细胞必须首先从血管到达肿瘤部位，然后才能发挥其杀瘤功能。影响T细胞趋化运动的关键因素是趋化因子和趋化因子受体(ChRs)介导的定向运动。因此，如果TCR-T细胞能够表达适当的ChR，就可以增加T细胞对肿瘤的浸润，从而提高TCR-T细胞的治疗效果。然而，ChR表达的调控机制还不是很清楚，而且很难通过细胞因子或药物添加来诱导特定的ChR表达；尽管可以通过基因工程的手段引入特定的ChR。多项研究证实，ChR基因工程可以改善T细胞的定向运动，提高免疫治疗的效果。据信，TCR-T细胞疗法也将从这些改进中受益。除ChR受体外，T细胞还表达多种协同信号受体，发挥免疫调节作用。具有代表性的共刺激分子有CD28、ICOS和4-1BB。当这些受体与相应的配体结合时，可以提供共刺激和共抑制信号。在没有共刺激信号的情况下，T细胞在持续的抗原刺激下会耗尽。T细胞的增殖能力和效应功能降低，共抑制分子表达上调。从理论上讲，应该可以通过激活共刺激分子来增强T细胞的功能。然而，使用该分子激活的抗肿瘤抗体的临床研究表明，这种治疗策略的有效性有限。因此，这可能不是提高T细胞在肿瘤治疗疗效的最佳选择。相比之下，靶向共抑制分子的治疗方案取得了更好的效果。具有代表性的共抑制分子是CTLA-4和PD-1。临床研究表明，同时阻断PD-1或CTLA-4/PD-1与免疫治疗对多发实体瘤有协同作用。因此，在TCR-T细胞治疗中应考虑T细胞与共抑制分子的结合。

( 八)、TCR-T细胞治疗的临床试验

TCR-T细胞疗法的临床试验早在1998年就开始了，但在2006年MART-1特异性TCR-T细胞被成功用于治疗黑色素瘤之后，开始了越来越多的临床试验。目前，TCR-T细胞正在进行黑色素瘤、滑膜肉瘤、直肠癌、食道癌和骨髓瘤的临床试验。已有100多项TCR-T细胞临床试验已注册。其中，一些临床试验已经有了研究成果并发表了报道其疗效的文章，为未来TCR-T细胞的过继输注治疗提供了重要参考(表3)。此外，大量针对TCR-T细胞治疗的临床试验目前正在招募中(表4)。

表3 已发表的TCR-T细胞临床试验

表4 招募TCR-T细胞临床试验

TCR-T细胞治疗血液系统肿瘤

尽管临床研究很少，但TCR-T细胞治疗在血液系统肿瘤中取得了良好的效果。经过改造的高亲和力TCR使CD8+T细胞对含有新抗原的肿瘤具有特异性的细胞毒作用。2012年一项试验(NCT01640301)试图用WT1高亲和力CD8+T细胞治疗急性髓系白血病，但该试验目前已结束招募，结果尚未报道。2018年，NCT02770820使用WT1特异性中央记忆和幼稚CD8+TCR-T细胞治疗急性髓系白血病。与此同时，另一项NCT03326921使用HA1特异性记忆TCR-T细胞治疗复发性急性混合白血病入选患者。针对复发融合基因CBFB-MYH11的TCR在体外和融合基因驱动的AML患者来源的小鼠异种移植(PDX)模型中赋予CD8+T细胞抗白血病活性。同样，在异种移植模型中，转导了对突变的KRAS变体G12V和G12D高反应的TCR的外周血淋巴细胞可以识别多个携带适当KRAS突变的HLA-A*11:01+胰腺细胞系(IND27501)。2015年，马里兰大学医学院、宾夕法尼亚大学医学院和Adaptimmune公司联合进行了NY-ESO-1特异性TCR-T细胞疗法的研究，在多发性骨髓瘤患者中，80%的患者临床反应良好，70%的患者完全或接近完全缓解，平均无进展生存期达到19个月。

TCR-T细胞治疗黑色素瘤

黑色素瘤是皮肤癌中恶性程度最高的肿瘤之一。一旦发生转移，对术后辅助放化疗不敏感，预后很差。目前，TCR-T细胞免疫治疗对黑色素瘤的临床研究最多，靶点为MART-1、P-gp100、NY-ESO-1、MART-A3和p53。TCR-T细胞的大规模试验始于2006年，有两项针对转移性黑色素瘤的试验。其中，Duval等人治疗15例黑色素瘤分化抗原MART-1特异性TCR-T细胞，虽然只有1名患者部分应答，但该报告表明，TCR-T细胞疗法在人身上是安全的。随后，Morgan等人报道了MART-1特异性TCR-T细胞用于治疗17例黑色素瘤患者的临床研究结果，发现体外扩增的TCR-T细胞可以在患者体内长期存活(检测时最长可达2个月)，其中2例患者可高水平存活长达1年。2例患者均取得了客观缓解。此后，随着对TCR-T细胞研究的深入，研究人员认识到TCR亲和力与治疗效果密切相关。当使用高亲和力的TCR-T细胞时，患者的应答率显著增加。Johnson等人用MART-1高亲和力TCR-T细胞治疗20例转移性黑色素瘤患者，发现治疗后客观缓解率达30%(NCT02654821；NCT00910650；NCT00509288)。影响TCR-T细胞疗效的另一个重要因素是肿瘤中特定抗原的表达，抗原表达越广泛，特异性TCR-T细胞的治疗效果就越好。一个典型的例子是CT抗原NY-ESO-1。NY-ESO-1在肿瘤中的表达非常普遍。Robbins等人观察NY-ESO-1特异性TCR-T细胞治疗黑色素瘤的疗效，结果显示大多数黑色素瘤患者有客观的临床反应，黑色素瘤患者的3年和5年生存率为33%。由于TCR-T细胞需要共刺激信号来激活和增殖，DC细胞可以增强TCR-T细胞的治疗效果。Chodon等人观察DC疫苗联合MART-1特异性TCR-T细胞对13例转移性黑色素瘤患者的治疗效果，结果显示69%的患者有明显改善(NCT00670748；NCT00670748；NCT02070406；NCT03399448)。

此外，Morgan等人也提出了自己的观点，以MAGE-A3为靶抗原将TCR基因导入T细胞治疗转移性黑色素瘤患者。I/II期临床试验结果显示，疾病缓解率为57%(4/7)，其中1例CR持续15个月，3例PR (其中2例PR 4个月，1例PR 12个月以上)。然而，这项临床试验中的3名患者出现了由脑损伤引起的精神障碍，其中2名患者出现严重的中枢神经系统损害并死于多灶性坏死性白质脑病，这可能是由于正常脑组织中MAGE-A12抗原的交叉识别介导的神经毒性(NCT01273181；NCT01350401；NCT01352286；NCT02111850)。Johnson等人用黑色素瘤相关抗原肽P-gp100和p53制备高表达TCR活性的TCR-T细胞，用于治疗转移性黑色素瘤患者，疾病应答率分别为18.75%(3/16)和0%(0/10)。前者2例PR，1例CR，未见不良反应(NCT00509496；NCT03412877)。

TCR-T细胞治疗消化系统肿瘤

Rosenberg的团队使用突变的抗原特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞分别治疗胆管癌和结肠癌患者，取得了良好的效果。2017年，该研究团队进行了HLA-DPB1限制性MAGE-A3抗原特异性TCR-T细胞的临床试验。这项研究取得了令人振奋的结果，1名食道癌患者获得了长达4个月的部分缓解(NCT01273181)。然而，TCR-T细胞的临床试验仍存在明显的不良反应。例如，在2011年的CEA抗原特异性TCR-T细胞临床试验中，3名患者发生了不同程度的结肠炎，主要原因是这些高亲和力抗原特异性TCR-T细胞识别表达CEA的正常结肠上皮组织的能力，这被称为脱靶现象(NCT00923806)。

AFP是目前研究最广泛的肝癌靶抗原。AFP是胎儿时期肝脏合成的一种糖蛋白，其在成人血清中的水平很低，但恶性变化的肝细胞可以恢复其合成能力。因此，AFP可作为肝癌细胞的特异性抗原，作为细胞免疫治疗的靶点。已获得能识别AFP 158-166多肽的特异性TCR，X-Scan检测表明它不与人蛋白质数据库中的其他多肽发生交叉反应，避免了脱靶效应。TCR-T治疗肝癌的临床试验目前正在进行中，通过检测活检组织中AFP的表达和T细胞的渗透，以及密切监测肝脏的生化标记物来证实其疗效(NCT03132792；NCT02686372；NCT02719782；NCT04677088)。现有的NY-ESO-1特异性TCR对NY-ESO-1 157的识别最为突出，有报道称NY-ESO-1 157的TCR-T在肝细胞癌患者，尤其是Treg细胞耗竭患者中能产生应答。此外，NY-ESO-1在某些肝细胞癌患者的肿瘤中高表达。因此，一些药物也被用于肝癌的临床治疗试验(NCT01967823；NCT02869217；NCT03159585)。HBV和HCV感染是肝癌的主要病因之一，患者肿瘤组织中病毒相关蛋白的表达可作为TCR-T治疗的靶抗原。研究人员确定了HBsAg特异性TCR，并进行了几项临床治疗试验。由于HBsAg在非肝癌组织中也有表达，其肿瘤特异性较低，因此上述试验仅限于预防肝癌患者肝移植后复发(NCT03899415)。

TCR-T细胞治疗滑膜细胞肉瘤

滑膜细胞肉瘤是一种极为罕见的软组织恶性肿瘤。目前，该病主要以手术治疗为主。其特点是局部侵袭率高，转移率高，转移患者预后差。Robbins等人将针对NY-ESO-1癌睾抗原的TCR基因导入自体T细胞治疗滑膜细胞肉瘤患者。I期临床试验结果显示，疾病PR为66.7%(4/6)，其中1例PR持续18个月，未见明显不良反应。四年后，再次使用针对NY-ESO-1的TCR-T细胞治疗滑膜细胞肉瘤患者，II期临床试验结果显示有效率为61%(11/18)。其中10例PR，1例CR超过20个月，3年和5年生存率分别为38%和14%，均出现短暂性中性粒细胞减少和血小板减少，但未见明显不良反应(NCT01343043；NCT03697824；NCT03967223)。此外，Morgan等人以MAGE-A3为靶抗原将TCR基因导入T细胞治疗滑膜细胞肉瘤1例。结果表明，PR持续5个月，无任何神经毒性症状。TCR-T细胞免疫治疗可以延长滑膜细胞肉瘤患者的生存期，但仍有部分患者对治疗无效，其机制尚不清楚。特别是对于大多数恶性肿瘤表达的NY-ESO-1靶抗原，仍有一些患者在接受TCR-T细胞免疫治疗时没有表现出治疗应答。这提示可能存在其他因素(如肿瘤抗原缺失和低表达等)。值得思考和探索，最终找到一种合适的方法来避免TCR-T细胞的免疫逃逸。

TCR-T细胞治疗其他类型肿瘤

除了治疗恶性黑色素瘤患者和消化系统肿瘤外，TCR-T细胞还在食道癌、多发性骨髓瘤、转移性宫颈癌、转移性结直肠癌、尿路上皮癌、骨肉瘤、乳腺癌等肿瘤的治疗中取得了良好的临床疗效，至今仍取得良好的临床疗效。在食道癌的TCR-T临床研究中，Kageyama等人以MAGE-A4为靶抗原将TCR基因导入T细胞治疗食道癌10例，其中3例存活超过27个月，7名患者在治疗后2个月内出现疾病进展(PD)，但没有观察到与治疗相关的不良反应。然而，Davis等人和Morgan等人进行的类似研究没有发现显著的治疗效果，后一项研究中的患者在昏迷后死亡。在一项招募晚期胰腺癌患者的临床试验(NCT04146298，NCT05438667)中，研究了经工程设计表达针对HLA-A*11:01呈递的公共肿瘤抗原KRAS-G12V或G12D的TCR的自体T细胞的安全性和有效性。此外，与个性化新抗原特异性TCR一起设计的自体T细胞也被用于实体肿瘤，如卵巢癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌和妇科癌(NCT05292859、NCT05194735、NCT04520711)。

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