具有良好特征的福尔马林固定石蜡包埋（ FFPE ）组织对于未来的生物标志物发现研究具有重要价值，而高通量和良好重复性的方案在 蛋白质组学 中是必不可少的。2021年01月01日，来自隆德大学生物医学工程专业Melinda Rezeli教授团队在Journal of Proteome Research杂志上在线发表了题为“Proteomic Workflows for High-Quality Quantitative Proteome and Post-Translational Modification Analysis of Clinically Relevant Samples from Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Archives”的研究论文。该研究提出了一种针对FFPE组织优化的可重复的样本制备工作流程，并首次证明了在FFPE组织中研究内源性赖氨酸乙酰化是可行的，有助于更好地利用现有的组织档案。 在过去的十年中，FFPE组织的使用在 蛋白质组 学研究人员中引起了越来越多的兴趣，尤其是在癌症研究领域。在癌症研究中，赖氨酸乙酰化等翻译后修饰的研究非常重要，因为它涉及许多细胞过程，包括代谢途径和转录的调节。因此，可以在FFPE组织样本中研究内源性乙酰化是非常有价值的。 该研究介绍和评估了S-Trap技术在基于质谱的蛋白质组学FFPE生物样品处理中的应用。该研究使用不同FFPE组织类型样本，使用高度重复性的S-Trap消化方法。TMTpro-16plex可直接在S-Trap洗脱的多肽上进行标记，不需要额外的除盐步骤，减少了样品处理流程和处理时间。此外，作者还开发了一种基于S-Trap的内源性乙酰化的快速样品制备方案，并且证明了研究FFPE组织样本中的内源性乙酰化是有意义和有效的。  17例肺腺癌（LUAD）患者的FFPE组织样本；3例恶性黑色素瘤（MM）的FFPE组织样本和冰冻组织样本；扁桃体FFPE组织    无二甲 /苯脱蜡和蛋白质提取结合S-Trap消化该研究使用了一种无二甲 /苯的脱蜡方法，该方法能够有效地去除大块石蜡，而不会造成任何实质性的蛋白质损失。对于蛋白质提取，使用两种缓冲液(1)含有25 mM DTT和10%-SDS的100 mM TEAB缓冲液（称为SDS缓冲液）和(2)含有8M尿素的100 mM AmBic缓冲液（称为尿素缓冲液）。提取后，将等量的蛋白质加载到S-Trap柱上，并在消化之前洗去提取缓冲液。然后采用双酶（LysC-胰酶）消化，在用胰酶消化过夜之前增加两小时的LysC消化步骤，以减少漏切并提高了消化的重复性。两种提取方法在蛋白质水平上观察到相似的鉴定数量和大量重叠情况 (SDS: 4577 ；尿素: 4263) (图1A) 。为了评估实验重复之间的定量重复性，对常见的蛋白质进行了Pearson 相关性分析（图1C）。在SDS和尿素样品中蛋白质丰度的所有配对比较之间都观察到了很好的相关性，所有重复比较的r都在0.98以上。这证明了S-Trap消化方法的高实验重现性和良好性能。此外进一步分析了这两种提取方法所获得的蛋白质组，对所有鉴定的蛋白质的物理化学性质进行了评估（图1D、E）。总的来说，这两种方法显示出高度相似的分布模式，无论是相互比较，还是与理论上的人类蛋白质组相比都是如此。 图1. SDS和尿素提取方法的比较
S-Trap消化结合TMT标记本文的S-Trap消化方式与TMT标记兼容，而不需要额外的样本处理。采用SDS蛋白提取方法针对LUAD患者标本使用96孔板进行S-Trap消化，然后用TMTpro-16plex标记。结果显示标记效率在99%以上，表明了从S-Trap洗脱出来的多肽与TMT标记方案是兼容的，并且标记前没有进行多肽除盐。该方法减少了样品处理步骤，增加了样品回收率，并缩短了准备时间。共分析了14例LUAD患者的原发肿瘤样本，采用高pH-RP分馏共计24个组分，共鉴定到143,048个多肽，9585个蛋白，7936个可定量蛋白。接下来探索了与患者生存相关的蛋白质和途径，使用关键蛋白进行层次聚类分析（图2A）。在存活四年以上的患者中，观察到与免疫系统、翻译、细胞激活、应激反应、蛋白质运输和蛋白质输出相关的通路显著富集，而对于诊断后存活不到四年的患者，观察到与DNA修复、蛋白质修饰过程和运动相关的通路显著富集（图2B）。火山图显示存活时间短的患者中有19种蛋白质上调（红点）和存活时间长的患者（蓝点）中的有33种蛋白质上调（图2C）。在 52 种差异表达的蛋白质中，发现了与预后和生存相关的候选蛋白，例如GZMA、CD40、TAP1、SDC4和APOA1。 图2. LUAD患者的蛋白组数据分析
S-Trap方法研究内源性赖氨酸乙酰化为了研究内源性乙酰化，作者开发了一种基于S-Trap的快速样品制备方案，其中包括使用氘化N-acetoxisuccinimide对蛋白质的游离氨基进行化学乙酰化，以便能够在MS分析中区分化学标记的乙酰化和内源性乙酰化。由于胰蛋白酶在存在乙酰赖氨酸的情况下不能裂解肽键，因此消化的肽将只切割精氨酸残基，这导致与经典胰蛋白酶消化所形成的肽是不同的。作者利用扁桃体FFPE组织来评估基于S-Trap的乙酰化方案，并将其与常规胰酶消化进行比较，每种方法进行三次技术重复。两种方法蛋白质水平的鉴定数目非常相似，S-Trap的乙酰化方案鉴定出5191个蛋白，常规胰酶方案鉴定出5103个蛋白质。为了探索这两种方法的互补性，研究了两种方法之间的蛋白质重叠。在蛋白质水平上观察到68.8%的重叠（图3C），显示了所获得的蛋白质组的互补特征。然而，鉴定的蛋白质序列的平均赖氨酸含量（鉴定序列中的K频率）在乙酰化法中高于经典胰酶消化法，中位数分别为5.6%和4.0%。因此，乙酰化方法可能有助于研究富含K的蛋白质区域。为了研究S-Trap乙酰化方案是否可以用作传统胰酶消化方案的补充或替代方案，斯皮尔曼相关性分析(图3E，相关系数为0.80-0.81）显示两种方法具有较好的一致性，S-Trap乙酰化方法既可用于研究内源性赖氨酸乙酰化，也可用于整体蛋白质组研究。 图3. 乙酰化方案和常规胰酶方案比较

在扁桃体FFPE组织中共鉴定到1339个蛋白质中的1839个内源性乙酰化肽段。其中1034个之前已被报道过乙酰化，根据PhosphoSitePlus (v.6.5.9.1) (www.phosphosite.org)。这些结果表明，大约26%的所有已鉴定蛋白含有至少一个乙酰化位点，这与之前的研究报告的蛋白质水平25%至30%的乙酰化相当。为了进一步评估研究FFPE组织内源性赖氨酸乙酰化的可靠性，使用来自3名MM患者的成对FFPE和冰冻组织样本对所开发的方法进行了评估。可以鉴定出2336和2665个内源性乙酰化肽，分别对应于FFPE和冰冻组织中的1698和1884个蛋白质，其中超过70%以前报道为乙酰化。为了论证在FFPE组织中研究赖氨酸乙酰化的可行性，以含有两个赖氨酸残基的组蛋白H3肽（KSTGGKAPR）为例，比较了FFPE和冷冻组织中的定量分布。图4A显示了具有不同内源性乙酰化程度的H3肽的串联质谱图，还展示了每个乙酰化状态的相对比例(图4B)。与冷冻组织样本相比，FFPE中观察到的相对比例略有增加。总体而言，同一组织类型内不同患者之间的关系非常相似，可以得出结论，FFPE组织中的乙酰化定量分析与冷冻组织样本分析一样，对于患者之间的相对比较是有效的。 图4. KSTGGKAPR多肽的MS/MS和MS质谱图

综上所述，与S-Trap相适应的乙酰化方法具有很好的定量重复性，在多肽和蛋白质水平上的变异系数都很低。此外，还证明了乙酰化方案是对经典胰酶消化的一个很好的补充，可以增加 蛋白鉴定 的数量。乙酰化方法也可以作为经典胰酶消化的替代方法，以实现对内源性乙酰化和整体蛋白质组的同时评估。作者还证明了研究FFPE组织样本中的内源性乙酰化是有意义和有效的，配对的FFPE组织样本与冷冻组织样本的结果是一致的。这项研究旨在促进世界各地所有有价值的FFPE档案的使用，改变我们在蛋白质组学研究中看待FFPE样本的方式。


福尔马林固定石蜡包埋档案中临床相关样本的高质量定量蛋白质组工作流程及翻译后修饰分析
期刊名称：Journal of Proteome Research
影响因子：4.074
样本选择：FFPE组织和冷冻组织技术策略：蛋白质组学和乙酰化蛋白质组学